摘要:目的探究HIV感染者急性期血浆CCL2水平与病毒载量相关性以及动态变化关系。方法选取中国医科大学附属第一医院红丝带门诊HIV感染者54例,对样本的CCL2水平、病毒载量进行分析。结果急性期CCL2表达水平与病毒载量呈正相关(r=0.292 0,P=0.046 4);急性期CCL2水平与病毒载量存在一致的动态变化关系,在ART中断后,CCL2表达水平随着病毒载量增高而增高。急性期CCL2水平与HIV感染1年时间点的病毒载呈正相关,ROC曲线分析显示急性期血浆CCL2水平对HIV感染1年后病毒载量高低分组(高组≥4.5 Lg copies/mL,低组≤3.5 Lg copies/mL)的预测价值为80.30%(AUC=0.803 0,P=0.044 4),Kaplan-Meier生存分析显示急性期CCL2 high组(≥12.30pg/mL)的HIV感染者,其发生高水平病毒载量(≥4.5 Lg copies/mL)结局事件所需时间更短(P=0.033 9)。结论 HIV感染者急性期血浆CCL2水平与病毒载量水平呈正相关,急性期血浆CCL2高表达预示HIV感染者体内更快的疾病进展。CCL2有希望作为一个阻断靶点,限制HIV的侵袭能力。
据UNAIDS估计2019年有约170万名HIV新发感染者,全球的HIV流行趋势依旧不容小觑[1]。HIV急性感染后会导致CD4细胞的耗竭、免疫激活和机体的炎症状态,随着免疫系统的异常激活,HIV通过诱导固有免疫反应,刺激不同免疫细胞亚群细胞因子分泌增加,进而引起“细胞因子风暴”,这也是HIV早期感染的重要特征之一[2]。促炎细胞因子的广泛上调,被认为可能与HIV感染相关疾病进展和死亡相关[3,4,5]。
趋化因子属于细胞因子超家族中的小分子蛋白质,控制表达七个跨膜G蛋白偶联受体(G ProteinCoupled Receptors,GPCRs)细胞的运动[6]。趋化因子根据其结构特征分为四个亚家族:CXC、CC、CX3C和XC。目前已鉴定出17种CXC趋化因子、28种CC趋化因子、1种CX3C趋化因子、2种XC趋化因子和20种趋化因子受体[7]。这些小分子蛋白质负责招募和指导免疫细胞运输和迁移。大多数趋化因子作为促炎因子参与广泛的生理和病理过程,如血管生成、过敏反应、感染、炎症等[8]。由于趋化因子的表达受到严格调节,所以其表达失衡可能导致严重的自身免疫性疾病和炎症状态。鉴于其在免疫调控中的关键作用,多种趋化因子和趋化因子受体已被确定为多种疾病的潜在治疗靶点[9,10,11]。CCL2,也称为单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),是首个被发现的人类CC趋化因子家族成员[12]。已有研究表明HIV感染后CCL2表达水平上调[13,14,15]。FLORIS-MOOREM等[16]发现血浆CCL2水平与同期病毒载量水平呈正相关,而与CD4细胞计数呈负相关。但有关HIV急性期感染者血浆CCL2水平与HIV感染相关疾病进展的关系尚待研究。本研究通过分析HIV感染者急性期血浆CCL2水平与不同时间点HIV病毒载量的关系,评估了急性期血浆CCL2水平对HIV感染者病毒载量水平的预测能力,并为急性期HIV感染的临床治疗提供了实验室数据。
1、资料与方法
1.1样本来源
研究对象来自国家卫生健康委员会艾滋病免疫学重点实验室(中国医科大学第一附属医院)的MSM前瞻性开放队列[15]。入选队列时HIV阴性,每1~3个月进行一次HIV抗体筛查。从中选取于随访期间确诊HIV感染的54例感染者进入本研究,此后随访观察1年或至调查对象启动ART为止。分别获取研究对象HIV感染前(HIV-RNA阴性)、HIV急性期感染(HIV-RNA阳性)、HIV感染一年(HIV-RNA阳性,病毒载量大于20 copies/m L)三点的临床信息和血液样本结果。HIV急性期感染(Primary HIV infection,PHI)指HIV感染早期(大约在HIV感染的12周以内)。HIV感染时间的判断标准为:1)参考Fiebig分期;2)若患者能够清楚地回忆起高风险暴露的时间,则该时间点是估计的感染时间;3)最后一次HIV抗体阴性试验和第一次HIV抗体阳性试验之间的中点是估计的感染时间。所有受试者均签署了知情同意书,本研究由中国医科大学第一附属医院医学科学研究伦理委员会伦理审查批准[编号:(2018)2015-140-5]。
1.2方法
1.2.1 HIV病毒载量检测
对HIV急性期感染及HIV感染1年时的样本进行HIV病毒载量检测。反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测血浆HIV RNA水平。使用COBAS Ampliprep/COBAS Taq Man48(Roche Diagnostics,USA)分析仪进行检测,检测范围为20~1.0×107copies/m L。
1.2.2血浆CCL2检测
对HIV急性期感染时的样本进行血浆CCL2水平检测。使用Bio-Plex Pro™趋化因子板40-Plex(BIORAD)测定血浆CCL2浓度。采集受试者全血并分离血浆,向Bio-plex板各反应孔中加入50µL beads,每孔加入Bio-plex wash buffer 100µL洗板2次,随后加入50µL待测血浆样本,室温条件下避光震荡1 h,洗板3次后加入25µL抗体,在室温条件下避光震荡30 min,洗板3次加入SA-PE 50µL,室温条件下避光震荡10 min,上机(BIO-RAD,Bio-Plex 200)读板。
1.2.3 CD4细胞计数检测
对HIV急性期感染及HIV感染1年时的样本进行CD4细胞计数检测。将20µL Tri TEST anti-CD4-FITC/CD8-PE/CD3-Per CP(BD,Franklin Lakes,New Jersey,USA)与50µL EDTA抗凝全血共同加入计数管中,使用FACS Calibur流式细胞仪(BD Biosciences)进行检测计数以及利用MULTISET软件进行数据分析。
1.2.4 2名未接受和2名中途停用ART者的检测
研究队列中有2名至观察终点仍未接受ART的急性期感染者分别在感染前96天与感染前86天及后续随访过程中(感染后14天,22天,30天,37天,48天,77天,161天和感染后17天,39天,75天,96天,136天)进行了血浆CCL2和病毒载量检测。2名接受ART后因个人原因自行停药者,分别在感染前88天与感染前49天及后续随访过程中的抗体检测阳性时、ART启动时、停止ART 0.5个月和停止ART 1个月时分别进行了血浆CCL2和病毒载量检测。
1.3统计分析
正态性检验显示所有数据均不符合正态分布,均数使用中位数M(P25,P75)表示。根据未ART且观察到1年时HIV感染者病毒载量中位数M(P25,P75),分为病毒载量高组(≥P75Lg copies/m L),病毒载量低组(≤P25Lg copies/m L);按急性期血浆CCL2水平ROC曲线的cut-off值,将急性期血浆CCL2≥cut-off值为CCL2 high组,急性期血浆CCL2<cut-off值为CCL2 low组。应用Graph Pad Prism 8.0软件和SPSS Statistics 24.0进行统计分析。使用Spearman相关分析估计相关性。采用Kaplan-Meier生存分析,P<0.05被认为差异有统计学意义。
2、结果
2.1研究对象基本情况
54例HIV感染者全部为男性;中位年龄为32.5(28,41)岁,其中20~30岁19例,30~40岁20例,40~50岁10例,50岁以上5例;中位HIV感染时间为31(25,49)天;急性期时的中位CD4细胞计数与病毒载量水平分别为424(328,531)个/µL,78 500(11 370,753 000 copies/m L)。54例中有23例HIV感染者于急性期接受ART后退出研究队列,其余31例未接受治疗者感染1年时的中位CD4细胞计数与病毒载量水平分别为412(328,555)个/µL,22 887(3 850,36 600)copies/m L。
2.2急性期血浆CCL2水平与CD4细胞和病毒载量相关情况
对HIV感染急性期CCL2水平、病毒载量、CD4细胞计数进行分析。结果显示,急性期血浆CCL2表达水平与CD4细胞计数无明显相关性(r=-0.126 4,P=0.381 8,图1A),但急性期血浆CCL2表达水平与急性期病毒载量水平呈正相关(r=0.292 0,P=0.046 4,图1B)。
图1 HIV感染前后血浆CCL2水平及急性期CCL2水平与CD4细胞计数(A)病毒载量(B)相关性
2.3急性期血浆CCL2水平与急性期病毒载量间的动态变化趋势
对研究队列中2例急性期未接受ART感染者和2例急性期ART后因个人原因自行停药感染者,于每次随访采集血浆样本检测CCL2与病毒载量水平(5~8个采样点/感染者),以进一步探究急性期血浆CCL2与急性期病毒载量间的动态变化关系。如图2A,图2B所示,2名急性期未治疗感染者的CCL2水平与病毒载量变化趋势一致,CCL2与病毒载量均在感染50天左右达到峰值。2名停药感染者的病毒载量水平在停药后迅速反弹,并与CCL2波动模式相似(图3A,图3B)。以上结果说明HIV感染后,急性期血浆CCL2水平与病毒载量存在一致的动态变化关系,在停止ART后,CCL2表达水平随着病毒载量快速增高而增高。
2.4急性期血浆CCL2水平与HIV感染1年时的CD4细胞和病毒载量相关性
由于观察到HIV感染急性期血浆的CCL2水平与病毒载量存在正相关且动态变化一致,对31例未接受过ART者,评估急性期血浆CCL2水平与HIV感染1年时的病毒载量及CD4细胞计数之间的关系。分析结果显示急性期血浆CCL2水平与HIV感染1年时的病毒载量呈正相关(r=0.394 2,P=0.028 2,图4A),但急性期血浆CCL2水平与HIV感染1年的CD4细胞计数无明显相关性(r=-0.189 9,P=0.360 1,图4B)。结果表明,急性期血浆高水平CCL2可能预示着HIV感染1年更高的病毒载量水平。
2.5急性期血浆CCL2水平对HIV感染1年时的病毒载量水平的预测
31例未治疗HIV感染者感染1年时病毒载量中位数为4.13(3.58,4.57)Lg copies/m L,将31例感染者分为病毒载量高组(≥4.5 Lg copies/m L)和病毒载量低组(≤3.5 Lg copies/m L)。ROC曲线分析显示急性期血浆CCL2水平预测HIV感染1年病毒载量的能力为80.30%(AUC=0.803 0,P=0.044 4,图5A),约登指数最大时取cut-off值为12.30 pg/m L。根据ROC曲线所得的cut-off值,将HIV急性期感染者分为CCL2 high(≥12.30 pg/m L),CCL2 low(<12.30pg/m L)两组,并将病毒载量(≥4.5 Lg copies/m L)作为结局事件。Kaplan-Meier生存分析结果表明,CCL2high组达到结局事件病毒载量(≥4.5 Lgcopies/m L)所用时间比CCL2 low组的感染者更短,AIDS疾病进展更快(P=0.033 9,图5B)。
图2 2名急性期未治疗感染者(A、B)血浆CCL2水平与病毒载量动态变化关系
图3 2名急性期ART后停药者(A、B)血浆CCL2水平与病毒载量动态变化关系
图4急性期血浆CCL2水平与HIV感染1年病毒载量(A)、CD4细胞计数(B)相关性
图5急性期血浆CCL2水平(A、B)预测HIV感染1年病毒载量的疾病进展
3、讨论
本研究分析了HIV感染者急性期血浆CCL2水平与病毒载量间的关系,发现HIV感染急性期血浆CCL2水平较感染前增高,并与病毒载量呈正相关。HIV相关蛋白,如gp120,Tat等可以在不同细胞类型中直接诱导CCL2的表达和释放,其中gp120可以刺激间充质干细胞的CCR5表达,并激活磷脂酰胆碱(PC)特异性和磷酸肌醇(PI)特异性的PLC依赖信号通路,导致MAPK、ERK1/2和NF-k B激活,最终上调CCL2表达[17,18];另外,Tat主要通过MMP/PAR-1信号通路,作用于神经系统中的星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞,最终上调脑脊液中的CCL2表达[19]。因此,HIV感染后,HIV自身的结构蛋白可以特异性诱导不同细胞上调CCL2的表达,从而导致CCL2分泌显著增加。
由于本研究队列中有2名HIV感染者接受ART后因个人原因自行停药,因此研究了急性期未治疗感染者与ART后停药感染者的血浆CCL2水平与病毒载量的动态变化,发现血浆CCL2水平在HIV感染后迅速升高,CCL2变化水平与病毒载量一致。ART后,感染者体内病毒载量水平得以控制,并且血浆CCL2表达水平也显著下调,然而一经停药,病毒载量迅速反弹至检测限以上,血浆CCL2表达水平也随之上升,二者动态变化趋势相似。目前CCL2在HIV-1复制中的作用已经在体外HIV-1感染模型中得到证实,即CCL2被抗CCL2抗体阻断时,可大幅降低HIV复制水平[20]。此外,CCL2被证明可以直接影响HIV复制,促进HIV的整合和释放[21],HIV感染触发CCL2的诱导和释放,这招募了更多潜在的HIV侵袭靶点,如单核细胞和CD4细胞到感染部位,从而增加HIV复制的易感细胞池并产生高病毒滴度[22]。所以,尽管CCL2作为促炎因子在HIV感染过程中上调,但其招募CD4细胞、单核细胞等HIV易感靶细胞到达感染部位,最终起到了促进病毒侵袭与复制的作用。
此外,本研究发现HIV感染者急性期血浆CCL2水平与感染一年后的病毒载量呈正相关,ROC曲线与Kaplan-Meier生存分析也验证了上述结果,即当HIV感染者急性期血浆CCL2≥12.30 pg/m L时,其体内病毒载量很快便达到4.5 Lg copies/m L以上,从而更易导致高病毒血症结局的发生。推测急性期高水平的CCL2有利于增强HIV的复制能力,从而导致了更快的病毒载量进展。FANTUZZI L等[23]的发现也验证了这一推测,即在体外使用CCL2阻断抗体处理被HIV感染的巨噬细胞后,与未经处理的对照组相比,阻断CCL2后,被感染的巨噬细胞胞内HIV抗原积累以及p24释放明显减少。值得注意的是,研究发现HIV晚期感染者体内产生的CCL2可能会上调静息CD4细胞上CXCR4的表面表达,从而使CD4细胞对X4 HIV-1敏感[24]。以上研究显示高水平CCL2与HIV感染后较差的免疫应答之间也可能存在关系。这些结果表明CCL2可以通过多种途径增强HIV的复制能力以及促进CD4细胞的耗竭,下调机体抗病毒免疫应答能力,从而导致更快的HIV感染相关疾病进展。
综上所述,HIV急性期血浆CCL2水平对病毒载量具有重要影响。HIV感染可通过多种机制诱导各类细胞上调CCL2表达,而CCL2作为促炎因子,通过招募CD4细胞、单核细胞等易感靶细胞又进一步为HIV提供了更多侵袭靶点,最终促进了病毒载量水平的快速增高。在HIV感染过程中,CCL2与病毒载量之间相互促进,导致了高病毒血症的发生。本研究发现了CCL2与急性期HIV病毒载量存在一致的动态变化关系,并且急性期CCL2水平对HIV感染者病毒载量水平有一定预测能力。当急性期血浆CCL2≥12.30 pg/m L时,HIV感染者的病毒载量进展更快。因此,阻断CCL2有关信号通路的免疫调节可能是未来治疗HIV感染相关疾病的一个重要研究方向。
文章来源:郎斌,尹晓婉,王卓,于晓雯,张子宁,徐俊杰,丁海波,韩晓旭,姜拥军.HIV感染者急性期血浆CCL2水平与病毒载量关系分析[J].中国艾滋病性病,2022,28(01):10-15.
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