精氨琥珀酸合成酶60a前在肝脏中首次被发现[1,2,3]。20世纪六七十年代,通过同位素示踪等方法在洋刀豆、小麦芽、黑麦草、葡萄和豌豆子叶等多种植物中先后发现了植物体中尿素循环相关酶[4,5,6,7,8],但是至今并没有完全的证据表明植物中具有完整的尿素循环体系,相关的酶在不同的亚细胞结构中发挥各自的功能和作用[9,10,11,12]。精氨酸(Arg)在植物的生长发育和营养储存等方面发挥重要作用[13,14,15,16,17],多胺(PAs)以及一氧化氮(NO)的合成依赖于细胞中Arg的供给和可利用程度,是抗逆机制的关键因素[18,19]。精氨琥珀酸合成酶(ASS)作为将瓜氨酸(Cit)和天门冬氨酸(Asp)合成转化为精氨琥珀酸(Ass)的限制步骤起重要作用,精氨琥珀酸裂解酶(ASL)生成Arg用于各种代谢过程[20,21,22]。ASS至少直接参与了两个链式循环反应,一个是NO循环反应,虽然在植物中至今没有找到存在一氧化氮合酶(NOS)的有力证据,但是能够检测出NOS酶活性和NOS的类似物[23,24,25]。ASS在NO循环反应过程中起到关键作用,在释放NO的同时生成延胡索酸,NO在植物的生长发育和抗逆等生理过程中起重要的信号分子作用[26],而延胡索酸是三羧酸循环(TCA)的重要中间代谢物质;另一个是尿素循环反应,Arg在精氨酸酶(ARG)的作用下合成鸟氨酸(Orn)和尿素,Orn有多个代谢通路,可以合成Cit进而代谢生成ASS形成一个闭环循环反应,也可以合成PAs等物质[27]。Arg具有至少5个下游代谢通路,精氨酸脱羧酶途径、精氨酸脱亚氨酶途径、NOS途径、精氨酸酶途径、脒基转移途径和精氨酸氧化酶/脱氢酶途径[28]。PAs、NO、Pro、Cit、Orn、延胡索酸、γ-氨基丁酸(GABA)等都与ASS直接相关,进而影响多种氨基酸、脂肪、ROS等代谢活动以及生物和非生物抗逆胁迫反应[27]。显而易见,这些反应都受到ASS的调控。ASS虽然在动物界特别是人体中研究较多,其缺乏和缺陷可引起各种疾病[29,30],但其作用机理机制研究有限,在植物中的相关研究更为匮乏[31],其缺乏或缺失对植物是否也会引起致命的反应不得而知,其在植物中的转录、表达、调控等分子生物学方面的研究还没有相关报道,植物信号分子、植物激素对其代谢和调控不清楚,亟需研究和探讨。

棉花(棉属,Gossypium)是重要的经济作物,盛产天然植物纤维,棉籽油和高蛋白,是纺织、食品、精细化工等行业的重要原材料,对干旱和盐度具有一定程度的耐受性,研究棉花的氮代谢,不仅减肥减药,提高氮的有效利用率适应低氮营养环境,还可以增强棉花抗盐抗逆能力,扩大种植面积,提高产量品质。利用VIGS技术沉默棉花精氨琥珀酸合成酶基因(GhASS1),探索其缺失对棉花生理以及含氮化合物代谢的影响,来探讨精氨琥珀酸合成酶在植物中的作用和功能。

1、材料与方法

1.1试验材料

陆地棉(GossypiumhirsutumL.)‘农大7号’、‘珂字棉312’(‘Coker312’)种子由河北农业大学棉花育种组提供。病毒载体pTRV1、pTRV2质粒和pTRV2-GhCLA1菌株由河北省农林科学院棉花研究所迟吉娜研究员惠赠。大肠杆菌Top10、农杆菌GV3101由本研究所保存。

1.2棉花幼苗的盐胁迫

将去纤维的、大小均一、成熟饱满的籽粒,杀菌后,播种于营养土中(V(蛭石)∶V(营养土)=1∶1),每天光照培养16h,温度为(24±1)℃。棉花幼苗长到两叶一心后,挑选长势一致的幼苗,采用NaCl浓度200mmol·L-1的盐溶液营养钵底部吸收的方法至营养土饱和,以水做对照。

1.3VIGS载体的构建

分析研究[26]获得陆地棉(GossypiumhirsutumL.)精氨酸酶GhASS1基因序列信息后,利用PrimerPremier5软件设计引物(表1),并添加KpnI和BamHI酶切位点。以质粒pGN-GhASS1为模板,利用聚合酶ExmasterMix(康为世纪)进行PCR扩增,纯化后,将回收产物与TA克隆载体TOPO-T(北京艾德莱,Aidlab)连接,转化到大肠杆菌Top10中,37℃氨苄青霉素抗性(50μmol·L-1)选择性培养12h。挑取阳性菌株,LB液体培养基培养,提取质粒,通过PCR、双酶切和测序鉴定,选取测序正确的质粒,利用KpnI和BamHI(Thermoscientific)双酶切,获得的目的片段与同样双酶切的载体质粒pTRV2的线性载体连接,转化到大肠杆菌Top10中,卡那霉素(50μmol·L-1)选择性培养,挑取阳性克隆,PCR、双酶切鉴定,正确的重组质粒命名为pTRV2-GhASS1,并转入农杆菌GV3101中,于-80℃保存备用。

1.4农杆菌的侵染

将含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-GhCLA1和pTRV2-GhASS1农杆菌GV3101,分别以2%接种量接入50mLLB液体培养基(50μg·mL-1卡那霉素;50μg·mL-1利福平)中,28℃220r·min-1培养至菌液OD600为1.5左右;离心收集菌体,以适当体积的重悬液(10mmol·L-1MES,10mmol·L-1MgCl2,200μmol·L-1乙酰丁香酮)重悬菌体至OD600为0.8左右,制成侵染液,28℃静置3h。将侵染液按照V(pTRV1)∶V(pTRV2)=1∶1、V(pTRV1)∶V(pTRV2-GhCLA1)=1∶1、V(pTRV1)∶V(pTRV2-GhASS1)=1∶1混匀,准备侵染。选用‘珂字棉312’品种,在人工气候培养箱中进行繁育,光照10000lx,光照时间16h·d-1,温度(24±1)℃。萌发后7～10d,子叶完全平展开,将子叶背面轻轻划伤,用注射器将混合好的侵染液从伤口处注入整个子叶,避光24h后,正常培养(昼/夜温度(24±1)℃,光/暗周期16h/8h),对每侵染组处理20个单株,观察棉花的表型。

1.5实时荧光定量PCR

用EASYspinPlus植物RNA快速提取试剂盒、DNaseI柱上消化试剂盒和第一条链反转录试剂盒,提取纯化棉花不同器官的总RNA,并反转录成cDNA。Realtime-PCR用BIO-RAD荧光定量PCR-IQ5进行,利用对应的引物(表1),定量分析GhASS1在不同组织中的表达,反应体系(20μL):TransStartTopGreenqPCRSuperMix10L;正向引物(10μM)0.5μL;反向引物(10μM)0.5μL;模板(稀释10倍的cDNA溶液)1.0μL;超纯水8.0μL。反应程序:预变性,95℃,1min;变性,95℃,15s;退火/延伸60℃,45s,40个循环;每个反应均做3孔重复。采用2-ΔΔCt方法分析数据。

表1引物序列与用途导出到EXCEL

注:下划线为酶切位点;斜体为保护碱基。

1.6基因沉默效率检测

待侵染pTRV2-CLA1的棉花出现白化现象后,采集棉花叶片,用Aidlab公司提供的植物RNA快速提取试剂盒(RN09)和第一条链反转录试剂盒(PC18)的方法提取棉花叶片总RNA,反转录cDNA。以棉花组成型表达的泛素基因Histone3为内参基因(表1),进行realtime-PCR检测目的基因的沉默效率。

1.7对基因沉默后棉花的胁迫与生理检测

待棉花侵染后15d左右,侵染pTRV2-CLA1的幼苗新生叶片全部白化,检测侵染目的基因沉默后,选取长势一致的侵染pTRV2-GhASS1的幼苗,以200mmol·L-1NaCl胁迫幼苗,人工气候室中培养(昼/夜温度(24±1)℃,光/暗周期16h/8h)。接种侵染pTRV2空载体的棉花幼苗作为对照,试验组重复3次,每次处理各20株,7d后观察棉花表型。

NO采用碧云天公司一氧化氮检测试剂盒(S0021)提供的方法检测[32,33]。

多胺质量分数采用苯甲酰氯HPLC柱前衍生化法检测。液氮研磨叶片,用10mL离心管离心收集,用PBS(磷酸缓冲溶液中性)洗3次,离心。将细胞沉淀用5倍体积的10%高氯酸萃取(或者加入4mL预冷的5%HClO4),冻融法裂解细胞反复3次,转移至10mL离心管中,冰浴浸提5min;12000r·min-1,5min,4℃离心;将上清液贮存在-20℃或者直接分析,由ChattopadhyayMK提供的方法检测[34]。

氨基酸采用2,4-二硝基氟苯(DNFB)HPLC柱前衍生化法检测[35,36]。用PBS溶解液氮研磨的叶片,微量移液器吸取1mL原液于1.5mL离心管中,高速离心(10000r·min-1,2min)沉淀菌体等固形物。准确量取上清液2μL,加入装有0.2mLNaHCO3衍生缓冲溶液的5mL塑料离心管中,然后加入0.1mLDNFB衍生试剂溶液,摇匀,将塑料离心管置于60℃水浴中暗处恒温加热60min后取出,放置待溶液冷至室温后,加入PBS(pH值为7.0)定容缓冲液0.7mL并摇匀,放置15min后进行色谱分析,C18色谱柱,柱温33℃,波长360nm检测,流动相总流量为1mL·min-1。

2、结果与分析

2.1棉花GhASS1的表达模式

本研究选取陆地棉的多个组织提取RNA,通过qRT-PCR分析棉花各组织中GhASS1的表达量。以叶片为参照,GhASS1在棉花不同时期的组织器官中表达不同,分别为根(6.63±0.35)、茎(0.060±0.001)、叶(1.00±0.01)、花瓣(8.66±0.25)、花蕊(7.91±0.30)、纤维(0.57±0.01),在棉花幼苗期GhASS1在根部的表达非常活跃,相对表达量远远高于同时期的茎叶等组织器官,幼茎几乎没有表达。在棉花初花期幼嫩的花瓣和花蕊中GhASS1的相对表达量非常高,纤维中GhASS1的相对表达量极低,表明在棉花根和花中GhASS1的表达处于高水平的状态。棉花属于相对耐盐抗旱的作物,在盐胁迫过程中分析叶片GhASS1的瞬时相对表达量以0h为参照,分别为0h(1.03±0.26)、6h(2.66±0.21)、12h(1.40±0.10)、15h(1.38±0.03)、24h(2.47±0.33)、36h(1.78±0.16),发现其相对表达量总体呈增加趋势,并在6h和24h出现了两个高表达的峰值。

2.2棉花GhASS1沉默的表达检测与幼苗表型

棉花CLA1基因(GenBank登录号:KJ123647)在棉花中编码1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxyxylulose-5-phosphatesynthase),该酶参与叶绿体发育过程,进化过程中高度保守。当该酶缺失时植株就会表现出白化现象,CLA1基因突变体cla1-1有明显的白化表型[37],可作为VIGS体系的标记基因。选取棉花GhASS1开放阅读框468bp序列片段连接到pTRV2上,构建目的基因重组载体质粒,将该质粒命名为pTRV2-GhASS1,转化到农杆菌GV3101中,侵染棉花子叶,观察真叶表型。侵染pTRV1/pTRV2-GhCLA1的棉花幼苗(pTRV2-GhCLA1)从第二片真叶逐渐开始白化,侵染两周后,新生的真叶几乎完全白化(图1),而作为参照,注射了pTRV1/pTRV2的棉花幼苗(pTRV2)无白化现象出现,表明病毒诱导的基因沉默体系已经发挥作用。侵染3周后,选取表型突出的棉花叶片提取RNA,分析相关基因的转录水平,与空载体对照组相比,侵染pTRV2-GhCLA1的棉花中,GhCLA1几乎完全沉默,表达量下降90%以上,侵染pTRV2-GhASS1的棉花幼苗(pTRV2-GhASS1)GhASS1表达量显著下降,仅为对照组的18.47%,下降80%以上,沉默效果显著。侵染4周后观察GhASS1沉默后棉花表型,棉花株高发生了变化,其对照组株高(21.65±1.08)mm,叶片厚度为(0.432±0.020)mm,GhASS1沉默后棉花株高为(18.24±2.52)mm,叶片厚度为(0.336±0.020)mm,GhASS1的沉默引起了棉花幼苗生长的显著变化,生长缓慢,叶片变薄,证明VIGS系统有效将GhASS1沉默,并对棉花生长发育产生了影响。

图1VIGS侵染基因沉默后棉花表型

A.GhCLA1和GhASS1沉默后的棉花表型;B.GhCLA1和GhASS1沉默后的棉花叶片。

2.3盐胁迫下GhASS1沉默棉花的相关基因表达

Arg有多个代谢通路[28],本研究分析了GhASS1沉默后下游相关基因的转录水平。与对照相比,下游GhARG1、GhADC、GhODC呈现不同程度的下调表达,表现出了上下游相互协同性关系(表2),表明GhASS1对GhARG1、GhADC和GhODC具有正调控的作用。盐胁迫后,GhASS1迅速上调,而pTRV2参照组的GhARG1、GhADC和GhODC三个基因表达急速下调,GhARG1和GhADC逐渐恢复正常水平,而GhODC先急剧下调后在12h瞬时爆发,而后又被抑制。pTRV2-GhASS1沉默组盐胁迫后GhARG1表达上调,并在36h剧烈上调。但是GhADC和GhODC始终处于被抑制状态变化不大。与对照相比,GhASS1的沉默使GhADC、GhODC的表达始终受到抑制。

表2盐胁迫下GhASS1沉默棉花幼苗相关基因的相对表达导出到EXCEL

注:表中数据为平均值±标准差;同列数据后不同字母表示处理间差异显著(p<0.05)。

2.4盐胁迫下GhASS1沉默棉花的生理分析

GhASS1沉默的棉花中PAs质量分数和NO质量摩尔浓度也表现出相应的变化(表3、表4)。GhASS1沉默导致棉花叶片中腐胺(Put)、精胺(Spm)和亚精胺(Spd)三种多胺质量分数下降,当盐胁迫后,作为参照的pTRV2空载体组的棉花PAs质量分数升高,而pTRV2-GhASS1沉默组棉花则进一步降低,与对照组的差异更为显著。GhASS1沉默后导致NO质量摩尔浓度显著下降(表4,0h),随着时间推移NO质量摩尔浓度显著上升,说明ASS对NO的合成具有显著的影响,推测GhASS1沉默后NO产生可能与Arg积累等因素相关。

2.5盐胁迫下GhASS1沉默棉花的氨基酸质量分数

ASS是尿素循环代谢过程重要的限速酶,直接影响Arg的合成,进而影响氨基酸代谢[20]。基因沉默后,pTRV2-GhASS1沉默组棉花叶片总游离氨基酸质量分数与pTRV2空载棉花组比较,由(374.50±15.10)mg·g-1降为(144.30±8.80)mg·g-1(表5),游离氨基酸除Asn质量分数大幅度增加外,其余均显著降低,His、Lys、Gln、Tyr等差异极为显著,暗示GhASS1沉默造成了NH+4的堆积,最终转移给Asp形成Asn,氨基酸同化作用受到严重的抑制。

表3盐胁迫后GhASS1沉默棉花幼苗多胺质量分数导出到EXCEL

注:表中数据为平均值±标准差;同列数据后不同字母表示处理间差异显著(p<0.05)。

表4GhASS1沉默棉花幼苗NO瞬时质量摩尔浓度导出到EXCEL

注:表中数据为平均值±标准差;同列数据后不同字母表示处理间差异显著(p<0.05)。

200mmol·L-1盐胁迫后,与胁迫前比较,pTRV2空载体棉花叶片总游离氨基酸、Asp、Glu质量分数变化不大,但是Asn、Gln、Ser、Gly、Tyr质量分数显著增加,其中Gln质量分数为胁迫前15.81倍。其他氨基酸质量分数不同程度下降;pTRV2-GhASS1沉默组棉花总游离氨基酸质量分数增加极为显著,其中除Asn质量分数显著下降外,其他游离氨基酸质量分数都有所升高,尤其Ser、His、Lys、Tyr质量分数增加极为显著,这几种氨基酸都因为携带更多的含氮基团或者羟基而具有极性或者碱性。

Glu、Asp和Orn是合成Cit的重要原料,GhASS1利用Cit生成Arg,当GhASS1沉默后,这几种氨基酸质量分数均下降,尤其是Arg下降为pTRV2空载棉花组的22%。盐胁迫后与pTRV2空载棉花组比较,pTRV2-GhASS1沉默组棉花总游离氨基酸质量分数显著增加(表5),在检测的22种氨基酸中,除Asn、Glu、Gln、Thr、Phe氨基酸质量分数下降外,其他氨基酸质量分数都不同程度上升;进一步分析发现,与pTRV2空载棉花组盐胁迫前比较,各游离氨基酸质量分数Gln、Thr、Cys、Arg和Phe下降极为显著,达到了60%以下,而Orn、Ser、Gly、Lys和Tyr升高极为显著。

3、结论与讨论

GhASS1在棉花幼根、花瓣和花蕊中表达活跃,对盐胁迫敏感,迅速上调表达。GhASS1不仅仅控制Arg的合成,而且在整个氨基酸代谢中起重要作用。VIGS可以快速沉默目的基因,研究其功能和对作物的生长发育的影响,GhASS1沉默后,可能使棉花细胞完整性破坏,生长发育受到严重影响,叶子小而薄,植株矮小,生长迟缓,沉默使GhADC和GhODC表达下调,即使Arg水平升高。棉花中存在Arg-NO通路,NO的合成依赖Arg的质量分数而不完全与GhASS1相关。总之,GhASS1对棉花氮代谢至关重要,同时对棉花抗逆耐盐同样起到关键性作用。

表5盐胁迫后GhASS1沉默棉花幼苗叶片氨基酸质量分数导出到EXCEL

注:表中数据为平均值±标准差;同行数据后不同字母表示处理间差异显著(p<0.05)。

Arg作为植物中氮储存的重要氨基酸,同时调节NO、PAs和潜在的Pro的产生和补充[38]。植物通过硝酸还原酶(NR)把无机盐NO-3转化为有机氮,利用固氮菌固定N2,植物根直接吸收土壤中的无机铵(NH+4)或有机氮等多种途径吸收同化氮为生命体所利用。而且N的利用与C代谢关系密切,有学者提出,光合作用所产生的能量25%用于硝酸盐还原[39]。Arg是生物体中含氮最多的氨基酸,是体内氮代谢的重要枢纽,它主要来源于体外营养的供给,自身蛋白质的代谢,以及通过Glu-Orn-Cit-Ass-Arg生物代谢途径合成,其下游具有合成机体蛋白质、肌酸、尿素、PAs、NO、胍基丁胺、Pro等多个代谢途径,在生物的生长发育、抗逆抗病过程中发挥重要的功能[40]。GhASS1在棉花幼根、花瓣和花蕊中表达活跃,而这些都是发育比较旺盛的器官,可以促进Arg的合成与利用。与动物和微生物类似,植物体内利用Glu和NH+4为原始底物合成Orn,随后与CPSⅠ利用Glu和HCO-3合成的CP为底物,鸟氨酸转氨酶(OTC)催化Orn和CP形成Cit。反应需要的CP由ATP、HCO-3和谷氨酰胺的δ-氨基通过CPSⅠ产生。精氨酸的第4个N原子衍生自天冬氨酸(Asp),其通过ASS与Cit连接。作为OTC和ASS的底物,Asp和Gln是Arg合成的必需前体,最后在ASL作用下产生最终产物Arg和延胡索酸完成Arg的生物合成[41]。ASS催化过程需要消耗ATP,因为,消耗高能磷酸键而不可逆,是Arg合成的关键酶之一。植物组织中Arg水平可能受多机制的调控,因为大多数精氨酸生物合成或分解代谢基本不改变Arg浓度,而是保持着相对平衡[42]。但是,当GhASS1沉默后Arg水平下降极为显著,说明其是Arg合成的关键环节,而且影响了整个氨基酸的代谢,除Asn外,Arg、Glu、Asp等组成蛋白质的氨基酸水平都急剧下降。这可能是因为GhASS1沉默,位于叶绿体内的谷氨酰胺合成酶(GS2)活性受到影响,无机氮NH+4增加而转化为Gln,当氮碳比高时,Gln依赖天冬酰胺合成酶(ASN1)将氮流导向了Asn,进而Asn大量增加[43]。同时Cit-Arg代谢被抑制,NO质量摩尔浓度也随之下降。

PAs参与植物抵御环境胁迫的响应,发挥重要生理作用,其代谢是复杂的生理过程。Put是PAs和其他生物碱代谢的第一个关键环节,在植物体内,Put的合成一是由ARG经过ADC催化等系列反应而得,另一条途径是由Orn经ODC催化鸟氨酸脱羧生成。Put在亚精胺合成酶(SPD)催化加氨基生成Spd,而Spd能够在精胺合成酶(SPM)作用下合成Spm[44]。本研究中盐胁迫棉花幼苗GhASS1迅速上调,表明其对盐的敏感。GhASS1沉默后Orn和Arg水平下降,GhARG1、GhADC、GhODC表达也急剧下调。GhADC、GhODC受到强烈的抑制,Put合成受阻,Put、Spd和Spm质量分数显著下降。NO已经越来越被认为是一个新的信号分子,在各种胁迫下低浓度NO能迅速清除超氧阴离子(·O-2)和脂质自由基(·R),阻断包括脂质过氧化在内的ROS参与的各种伤害效应,而且能诱导抗氧化酶基因的表达,起到抗氧化功能[33]。在植物体内NO合成主要有NR、亚硝酸盐NO还原酶、黄嘌呤氧化酶和非酶促反应,以及NOS类似的酶活性通路等多种途径[23]。GhASS1沉默降低了N的有效利用,氨基酸的合成,破坏了碳氮代谢平衡,影响PAs和NO的产生和积累,导致植株生长发育受到严重影响,致使叶子小而薄,植株矮小,生长迟滞,N营养素利用不畅,其作用机理还需要进一步研究。

植物对非生物胁迫的抗性在过去几十年一直受到越来越多的关注。极端温度、降水量减少和通过灌溉逐渐盐渍土壤可能导致植物水环境破坏,最终影响作物的生长、质量和产量,渗透胁迫可能是减少水可用性或增加盐含量的结果[45]。植物通过Pro、Cit、Arg等氨基酸,PAs等相容性溶质的合成和积累来应对渗透胁迫,这种渗透调节过程使组织脱水反应缓慢发展,其在细胞质中以高浓度积累[46,47]。经热激预处理的棉花在干旱胁迫后40d时,叶片内Arg、Pro和Asn分别是对照植株中的240、160和150倍,比未经处理的棉花的耐渗透胁迫能力显著增强[48]。在花期喷施外源Arg可改善小麦的耐热能力,从而提高小麦产量[49]。高等植物中精氨酸代谢研究的最新进展主要集中在拟南芥的研究,明确了拟南芥中鸟氨酸生物合成循环途径。盐胁迫GhASS1沉默的棉花,除了Asn质量分数下降外,其余氨基酸则升高,特别是Ser、His、Lys、Tyr极性氨基酸增高水平极为显著。Arg具有多个代谢通路,当GhADC、GhODC表达持续受到抑制,代谢不畅、Arg质量分数增加时,GhARG1表达上调,ARG活性增强,NO质量摩尔浓度也显著增加,表明棉花具有Arg合成NO的通路。研究也说明,NO的合成,Arg质量分数高低是关键,ASS只是必要条件。在盐胁迫状态下是否存其他ASS同工酶,催化Orn-Cit-Arg途径,以及GhASS1与GhADC和GhODC的关系和作用机理还需进一步研究,本研究已经构建了过表达载体,正在进行转化,以期获得转基因棉花,并将进一步研究GhASS1在棉花氮代谢过程中的作用和机理。

参考文献:

[26]王慧飞,孙艳香,冯雪,等.棉花精氨琥珀酸合成酶基因GhASS1的克隆及表达分析[J].中国农业科学,2016,49(7):1242-1253.

[46]王慧飞,孙艳香,冯雪,等.植物中尿素循环相关酶及代谢产物研究进展[J].云南农业大学学报(自然科学),2018,33(2):334-342.

王慧飞,刘琳琳,甄军波,刘迪,欧阳艳飞,迟吉娜,冯雪,张一名,孙艳香,陈光.病毒诱导的精氨琥珀酸合成酶基因沉默对棉花氮代谢的影响[J].东北林业大学学报,2020,48(05):72-78.

基金:河北省科技重点研发计划项目(19275602D,17275608);河北省自然科学基金项目(C2015408022);河北省科技支撑计划子课题(16226303D-3);河北省农林科学院创新工程项目(2019-3-7-3).