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缝隙连接蛋白26突变导致遗传性耳聋的研究进展

2024-10-29 100 上传者：管理员

摘要：缝隙连接蛋白26(Cx26)是耳蜗中最丰富的缝隙连接蛋白之一，由GJB2基因编码，对耳蜗的发育与听力形成至关重要，Cx26突变患者可表现出不同程度的听力损失。学界曾普遍认为钾离子循环障碍是引起耳聋的主要机制，但近年的研究发现GJB2基因突变相关听力损失中的钾离子循环障碍与耳蜗的病理表型并不直接相关，而耳蜗的发育障碍与氧化应激系统在其中起着关键作用。文章总结了Cx26突变引起相关听力损失的病理生理机制，包括钾离子循环障碍、内耳发育障碍、氧化应激系统失衡等。阐明Cx26突变导致听力损失的病理机制有助于开发针对遗传性耳聋的预防和治疗策略。

关键词：
听力损失
氧化应激
相邻细胞
缝隙连接蛋白26
遗传性耳聋
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GJB2是最常见的遗传性非综合征性耳聋致病基因，主要编码缝隙连接蛋白26(Cx26)[1]。到目前为止，已经鉴定出21种人类缝隙连接蛋白，这些跨膜蛋白由六个相同或不同的缝隙连接蛋白单体组成，形成一个半通道，相邻细胞之间的两个半通道排列组成缝隙连接通道（GJCs），所有细胞的GJCs共同构成缝隙连接系统。GJCs允许相邻细胞间进行小分子物质交换，如离子、三磷酸腺苷（ATP）和microRNA等[2]。GJB2基因编码的Cx26和GJB6基因编码的Cx30是内耳最丰富的缝隙连接蛋白，它们广泛分布在螺旋器（OC）、螺旋韧带的成纤维细胞，以及血管纹的基底细胞和中间细胞等组织和细胞中，其中Cx26形成的GJCs对听觉功能的发展、形成和维持至关重要[3-4]。目前在人类GJB2基因中已发现100多个与听力损失相关的突变位点，且GJB2基因突变也参与迟发性耳聋、老年性聋的发生过程[5-6]。研究者利用GJB2基因敲除小鼠和GJB2点突变小鼠模型发现了许多有意义的病理表型，但GJB2突变导致听力损失的主要病理机制尚不清楚。本文综述GJB2相关听力损失研究的最新进展，以期为未来研究提供理论指导。

1、钾离子循环障碍

耳蜗是内耳中感知声音的主要器官，内部由三个充满淋巴液的腔室组成：前庭阶、中阶和鼓阶。前庭阶和鼓阶含有外淋巴液，二者通过耳蜗顶部的孔径相互连接，其成分与细胞外液相似，含高浓度的Na+和低浓度的K+。中阶则充满内淋巴液，与细胞内液成分相近，含有高浓度的K+和低浓度的Na+，这种独特的离子环境由内外淋巴液共同维持。经典的钾循环理论指出，当声音刺激作用于浸泡在内淋巴液中的毛细胞时，基底膜的振动会打开毛细胞顶部立体纤毛的机械通道，使内淋巴中的K+进入毛细胞，进而产生听觉所需的电流和电位[7]。进入毛细胞的K+随后通过底侧壁的Ca2+依赖性钾通道排出，再通过耳蜗侧壁的Deiter细胞与支持细胞之间由Cx26和Cx30形成的GJCs循环回内淋巴，以维持高钾状态。

Cx26的突变被认为会损害耳蜗GJCs的功能，从而破坏钾离子循环，导致K+在毛细胞周围积聚，最终引起毛细胞变性和听力障碍[8]。虽然这一过程曾被认为是GJB2相关听力损失的主要病理机制，但缺乏充分的直接实验证据，且该理论主要基于离子通道与连接蛋白之间的关系推测。此外，GJB2相关模型未能解释为何突变的Cx26或Cx30不能通过其他连接蛋白来补偿其功能[9]，例如，Cx30依然存在于GJB2突变小鼠的耳蜗中，并且GJB2突变小鼠内耳中的GJCs保留了正常的通道交换功能，表明其理论上仍具有K+循环能力。

更重要的是，在GJB2 R75W突变小鼠模型中尽管观察到听力损失，但内淋巴电位依然维持在正常范围，这表明损伤的钾离子循环功能并非Cx26突变引起听力损失的主要病理机制，而只是伴随现象。此外，有一种假说认为，在Cx26突变后，K+无法正常循环，导致其在毛细胞周围积累[10]。然而，GJB2突变小鼠在毛细胞损伤和钾离子循环障碍之前，已出现听力下降，这进一步表明钾循环可能并非GJB2相关听力损失的主要机制。

2、耳蜗发育障碍

正常小鼠在出生后并未完全形成听力，OC的发育需要约14 d才能完成。在这一过程中，发生了大上皮嵴的退化、螺旋隧道的开放以及Nuel间隙的形成等重要事件。在Cx26基因敲除小鼠模型中，LIN等[11]观察到螺旋隧道和Nuel间隙在出生后未能正常开放。GJB2 R75W突变小鼠也表现出类似的病理特征，而在其他类型的GJB22敲除小鼠中，发现毛细胞发生变性之前，内耳中的外毛细胞（OHC）发育停滞。螺旋隧道（TC）和Nuel间隙的正常形成是听力产生的重要前提，其结构发育的延迟将导致严重的听力损失。在携带突变位点GJB2 G45E杂合子的角膜炎-鱼鳞病患者中，也观察到OC的发育异常。此外，在GJB2变异小鼠中，发育异常的内毛细胞（IHC）和Nuel间隙也出现了相似的病理特征，这提示OC的异常可能与Cx26的缺失有关，最终导致听力下降。尽管GJB2突变引起OC发育障碍的具体机制尚未完全阐明，但现有研究[12]表明TC的开放与内外柱细胞之间密切相关。

INOSHITA等[13]观察到，在出生后第8天（P8），野生型小鼠与GJB2 R75W突变小鼠的TC开放过程中，柱细胞均由周围细胞分化而来。然而，GJB2R75W突变小鼠的内柱细胞微管数量显著减少，而对照组小鼠的柱细胞则富含微管。CHEN等[14]在Cx26条件敲除小鼠中也观察到耳蜗的类似病理变化，在P8时注射他莫昔芬（TMX）的GJB2条件敲除小鼠OC形态未见明显异常，但在P0时注射TMX的小鼠中，TC和OC在P5-P7期间未能正常开放，Deiter细胞也未能形成指突状结构，同时柱状细胞中的微管数量和乙酰化α微管蛋白的表达水平显著降低。由此可见，早期敲除GJB2基因可能导致柱细胞细胞骨架的发育紊乱。LIU等[15]指出，小鼠出生后早期GJB2基因的敲除导致柱状细胞中F-actin水平降低。QIU等[16]的研究表明，耳蜗中Cx26的敲除会形成异常的非中心体微管结构，并伴随着微管排列数量的减少，这可能会导致柱细胞微管的捕获和锚定功能障碍，从而引发OC的畸形。这些研究表明，Cx26的缺失引起的OC结构异常可能与柱细胞的细胞骨架发育紊乱密切相关。

TC的开放过程也可能与内外柱细胞之间连接的减少有关，而E-钙粘蛋白在这一过程中至关重要。DEFOURNY等[17]发现，Eph受体A4(EphA4）能够与A裂解蛋白和金属蛋白酶10(ADAM10）结合，从而促进内外柱细胞间粘附的降解。在缺乏ADAM10抑制剂或EphA4的情况下，柱状细胞之间基于E-钙粘蛋白的粘附连接无法正常降解。ZHANG等[18]在实验中观察到接受三碘甲状腺原氨酸处理的小鼠OC比正常小鼠更早打开，这一过程中柱细胞的乙酰化微管形成，而粘附连接的降解是通过P-钙粘蛋白而非E-钙粘蛋白完成的。目前大部分学者认为，柱细胞的高度和形态由细胞骨架的发育所维持，而内外柱细胞之间E-钙粘蛋白或P-钙粘蛋白形成的粘附连接参与小鼠OC的发育和成熟。此外，细胞骨架的异常发育可能导致其他问题，例如膜蛋白运输的障碍，从而影响细胞功能。GJB2基因的突变或敲除可能通过其他途径影响柱细胞的连接功能[19]，有研究[20]表明Tspan蛋白家族在其他组织中参与ADAM10剪接E-钙粘蛋白的过程。因此，有必要深入探讨Cx26与Tspan之间的关系，相关研究可为理解Cx26与听力损失的机制提供新思路。

3、氧化应激系统失衡

活性氧（ROS）是细胞内蛋白质磷酸化、离子通道交换和氧化还原过程的重要调节因子[21-23]。长时间的高浓度ROS暴露可能对蛋白质、脂质和核酸造成非特异性损伤，导致细胞功能的损伤甚至丧失。脑星形胶质细胞依靠Cx43形成的质膜半通道释放谷胱甘肽（GSH）以帮助神经元抗氧化，耳蜗支持细胞GJCs的细胞间耦合对GSH的释放和抗氧化作用的发挥也有重要意义[24]。FETONI等[25]分析比较了P5时Gjb2-/-小鼠与Gjb2loxP/loxP小鼠的mRNA表达谱，结果显示耳蜗的氧化代谢、抗氧化系统及GSH代谢等信号通路均被激活。进一步的耳蜗外植体体外研究表明，P5时Gjb2-/-小鼠的GSH水平明显低于Gjb2loxP/loxP小鼠。另外与对照组Gjb2loxP/loxP小鼠相比，六月龄Gjb2+/-小鼠GSH酰化蛋白在耳蜗的总量及它们表达在螺旋神经节神经元（SGN）、OC及血管纹等不同区域的表达量均明显降低。这些结果证明了Cx26缺失造成小鼠耳蜗抗氧化抵御系统的功能受损。二氢乙锭（DHE）是一种可快速渗透细胞膜的亲脂性染料，与超氧化物结合后会快速氧化为乙锭，可用于检测细胞的ROS水平。在Gjb2-/-小鼠和Gjb2loxP/loxP小鼠中均发现耳蜗中的DHE特异性荧光信号强度高于正常小鼠[25]。此外，在2月龄、6月龄和12月龄小鼠的耳蜗进行DHE与4-羟基-2-壬烯醛（4-HNE）特异性荧光染色，观察到Gjb2+/-小鼠耳蜗的荧光信号强度强于相同月龄的Gjb2loxP/loxP小鼠，然而2月龄Gjb2+/-小鼠并没有与Gjb2loxP/loxP小鼠一样出现听力下降。进一步研究[25]发现Gjb2+/-小鼠耳蜗中的抗氧化应激信号通路Nrf2/ARE及其下游产物HO-1酶均被激活。这些发现表明，氧化代谢和ROS在Cx26敲除小鼠的听力损失中有至关重要的作用。

在一项囊括4091名来自欧洲、高加索和中亚的人群的大型全基因组关联研究[25]中，研究者观察到Nrf2信号通路相关的基因（Prkce和Tgfb1）与Cx26相关的遗传性耳聋显著相关，进一步支持Nrf2信号通路对听力维持的重要作用。

4、ATP释放和Ca2+信号转导异常

ATP释放与相关钙离子信号转导在内耳的发育和听力形成中至关重要。作为一种神经递质，ATP的受体主要分为P1和P2两种嘌呤能受体，各自具有多种亚型。P2受体进一步分为P2X和P2Y，其中P2X受体是非选择性门控离子通道，对Na+、K+和Ca2+具有高度渗透性，而P2Y受体则是G蛋白偶联受体，通过激活磷脂酶C(PLC）启动甘油二酯和三磷酸肌醇（IP3）作为第二信使。

在大鼠耳蜗中，P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y6和P2Y12受体在感觉细胞和非感觉细胞以及螺旋神经节的神经元中都有不同程度的表达，而P2X2、P2Y4和P2X7则主要位于OHC表面，参与其纤毛活动。当ATP激活耳蜗中的P2Y受体时，依赖于IP3的PLC激活，促进内质网Ca2+的释放，从而提高细胞内钙离子浓度，触发钙信号转导。此外，ATP在未成熟耳蜗的发育过程中也参与了大上皮嵴和内毛细胞的电位活动[26]。有研究[27]表明，ATP诱导的IP3依赖性Ca2+信号以10至15 m·s-1的速度在耳蜗细胞网络中传递。

在小鼠耳蜗发育过程中，从大上皮嵴非感觉细胞释放的ATP波引起内毛细胞的Ca2+动作电位在自发去极化期间短暂爆发，促进毛细胞和SGN的成熟，并精细化耳蜗到中枢神经系统的轴突投射[28]。外源性ATP可直接使Ⅱ型神经元去极化，并刺激外毛细胞的谷氨酸突触输入，但这种作用会随着年龄的增长而减弱。有研究[29]显示，转染Cx43的体外培养细胞中ATP水平高于未转染细胞，表明星形胶质细胞和神经胶质瘤细胞的ATP释放可能由Cx43半通道介导。ZHAO等[30]研究发现，耳蜗支持细胞的缝隙连接蛋白半通道在生理条件下释放ATP，其浓度与耳蜗内的生理ATP水平相对应，解释了体内耳蜗液中测得的亚摩尔浓度。细胞外ATP可通过激活P2受体改变OHC的能动性，因此Cx26功能障碍可能导致OHC能动性受损，从而引发听力障碍。体外耳蜗培养实验[31]表明，缝隙连接蛋白在外沟细胞的ATP诱导Ca2+波中发挥重要作用。此外，钙离子减少会增加化学通道的开放，从而促进ATP通过缝隙连接蛋白半通道释放到内淋巴液。机械刺激也能诱发半通道开放，从而释放ATP，随着声音引起的机械振动增加，ATP释放量的增加可能降低OHC能动性，起到保护作用。

针对内耳的Ca2+信号和ATP释放的研究需要使用缝隙连接蛋白通道阻断剂和Ca2+指示剂等药物[32-33]。然而，目前大多数研究中使用的药物缺乏特异性，可能影响其他通道的活性，而内耳中表达ATP的通道可能包括缝隙连接蛋白通道和P2X7受体（P2X7Rs）等，因此有必要并建立更为严格的实验体系，以探明缝隙连接蛋白半通道的表达和功能。

5、其他

哺乳动物的螺旋血管系统存在于无血管的耳蜗底部，但目前普遍认为血管纹、螺旋韧带及螺旋缘中的血管网络也通过支持细胞的GJCs运输葡萄糖和其他代谢产物到感觉上皮细胞和毛细胞中。有研究[34]表明携带GJB2纯合突变的小鼠在孕早期及孕中期会胚胎致死，这是因为胚胎时期Cx26缺陷小鼠的胎盘难以从母体血液中吸收葡萄糖和其他营养物质，因此造成妊娠中后期胚胎器官发育障碍。支持细胞的GJCs进行细胞间耦联把营养物质从血管运输到远端神经元，FETONI等[25]评估了Gjb2+/-小鼠和Cx26敲除小鼠的葡萄糖摄取速率，他们用非代谢的葡萄糖产物2-NBDG进行荧光标记，观察到Gjb2+/-小鼠的血管纹中荧光量明显减少。Cx30在耳蜗中与Cx26共表达并且共定位于耳蜗相同部位，也被证明在耳蜗感觉上皮的能量供应中发挥不可或缺的作用，必需营养物质的缺乏降影响ATP的产生和正常功能并引起氧化应激和其他损伤。

6、总结与展望

由Cx26组成的GJC允许相邻细胞间交换如葡萄糖、第二信使、离子和miRNA等小分子，Cx26突变小鼠无法维持正常的耳蜗钾循环，导致耳蜗的主动放大功能受损。然而，K+循环障碍可能并不是Cx26突变相关耳聋的主要病理机制，Cx26突变会影响Ca2+信号传导、ATP释放以及柱状细胞骨架的发育，这些因素共同导致了听力损失。此外，最近的研究[35]发现，耳蜗巨噬细胞在Cx26突变小鼠的OHC丢失过程中发挥了作用，系统性应用地塞米松可有效防止OHC损失，从而挽救听力。

未来的相关研究应该在生理学基础上更深入地探讨Cx26蛋白的功能和调节网络。人工耳蜗植入已被证实是治疗因GJB2突变所致听力损失患者的有效方法。基因治疗在遗传性耳聋方面亦取得了重大突破，以腺相关病毒（AAV）为载体的基因治疗已显示出能够恢复GJB2突变小鼠的听力。通过向圆窗膜注入载有GJB2基因的AAV，成功地在耳蜗支持细胞中表达Cx26，帮助听力恢复和耳蜗结构的发育[36]。随着AAV血清型和衣壳修饰的不断改进，这项技术在临床上有望进一步发展为遗传性耳聋的主要治疗手段[37-38]。

基金资助:江西省自然科学基金青年项目(20224BAB216048);国家自然科学基金地区项目(82260223);

文章来源:柏雪,徐凯.缝隙连接蛋白26突变导致遗传性耳聋的研究进展[J].南昌大学学报(医学版),2024,64(05):94-98.