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lncRNALINC-PINT通过miR-425-5pPTCH1轴调节喉癌细胞干性

  2021-12-08    70  上传者:管理员

摘要:目的:探讨lncRNALINC-PINT通过miR-425-5p/PTCH1轴对喉癌细胞干性的影响。方法:采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法将LINC-PINT全长序列扩增并转染到HEp-2细胞,应用DianaTools、双荧光素酶报告分析系统分别预测和验证LINC-PINT及miR-425-5p的分子靶标,应用qRT-PCR和Westernblot检测LINC-PINT和癌细胞干性相关基因(Sox-2、CD44、CD133和Nanog)及其蛋白的表达。结果:转染LINC-PINT后证实LINC-PINT过表达会引起癌细胞干性相关基因表达下调,抑制miR-425-5p可引起癌细胞干性相关基因表达下调;LINC-PINT的分子靶标为miR-425-5p,且miR-425-5p的分子靶标为PTCH1。结论:LINC-PINT通过miR-425-5p/PTCH1轴抑制喉癌细胞干性而抑制喉癌的发生。

  • 关键词:
  • LINC-PINT
  • miR-425-5p
  • Ptch1
  • 喉癌
  • 肿瘤细胞干性
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长度约为200个核苷酸的非编码RNA被称为长链非编码RNA(lncRNA)。多项研究表明lncRNA在细胞生长和癌症中起一定作用[1]。生物信息学研究已将LINC-PINT确定为lncRNA之一。与正常组织相比,LINC-PINT在急性淋巴细胞白血病中表达下调[2]。在结直肠癌的独立队列研究中也观察到LINC-PINT的表达减少[3]。然而鲜有研究涉及到LINC-PINT在喉癌发生发展中的作用。

研究表明不同类型的lncRNA可以通过调节癌症干细胞(CSCs)的转录和下游信号通路来调节其生长和复制[4,5]。关于CSCs的研究综述了lncRNA在不同来源的干细胞中的作用[6,7,8]。CSCs拥有高度致瘤性,癌细胞干性的存在使它们能够自我更新和分化,使肿瘤能够再生[9]。然而喉癌与CSCs功能之间的关系却很少受到关注[10]。本研究探讨LINC-PINT通过miR-425-5p/PTCH1轴对喉癌细胞干性的影响,为喉癌治疗提供新线索。


1、材料与方法


1.1 一般资料

本研究在我院进行,手术前征得患者及其家属的同意,并签订了知情同意书。实验设计经本院批准,且其研究符合伦理委员会所制定的伦理学标准。收集了24份喉癌样本和配对的癌旁组织样本,并将其快速冷冻在液氮中,直到进一步分析。组织病理学分级由三位独立的病理学家盲法进行。24例患者中男18例(75%),女6例(25%);<60岁11例(46%),≥60岁13例(54%);肿瘤位于声门上4例(17%),声门19例(79%),声门下1例(4%);高分化12例(50%),中分化8例(33%),低分化4例(17%);Ⅰ+Ⅱ期15例(63%),Ⅲ+Ⅳ期9例(37%)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞系的维持和转染

人喉癌上皮细胞(HEp-2)取自美国典型培养体系(ATCC、Manassas、VA),按培养方案培养。即在含有10%胎牛血清(FBS,Invitrogen)的DMEM培养基(DMEM;Invitrogen,Carlsbad,CA)和100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素中培养。用CO2培养箱在湿化条件下(95%空气和5%CO2)将细胞系保持在37℃。

用于本研究的miR-425-5p、对照miRNA(miR-control)和miR-425-5p抑制剂(miR-425-5p-in)购自GeneChem公司(Shanghai,China)。用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法从HEp-2细胞中扩增LINC-PINT全长序列。将LINC-PINT扩增产物纯化后连接至pcDNA3.1载体。按照制造商的方案使用LipofectamineTM3000(Invitrogen)进行细胞转染。表1列出了miRNA的序列。

1.2.2 qRT-PCR检测基因表达的变化

临床样本和培养的细胞系均使用TRIzol试剂盒(TiangenBiotech,Beijing,China)进行总RNA提取[11]。使用RiboBiotech(Guangzhou,Guangdong,China)合成的基因特异性引物进行逆转录。使用SYBR预混液ExTaq试剂盒(TakaraInc.,Dalian,Liaoning,China)通过SYBR化学方法评估基因表达的变化。该分析在DNAEngineOpticon系统(Bio-Rad,Richmond,CA)中进行。该方法的循环条件为:95℃3min,变性;在95℃12s和62℃40s下分别进行40个循环的扩增。

用SYBR预混液ExTaq试剂盒(Takara)通过qRT-PCR对表达水平进行定量测定。qRT-PCR方法为95℃3min,扩增40个循环,95℃12s,62℃40s,在62℃~95℃范围内进行熔融曲线分析,记录读数0.2℃,保持时间2s,以管家基因GAPDH和U6snRNA为内参基因。基因表达的变化表现为折叠变化,用2-ΔΔCt计算方法得出。表1列出了实验中使用的所有引物。

1.2.3 肿瘤球体的形成

将HEp-2细胞(1×104个细胞)接种于6孔板(Corning,NY),在含有青霉素和链霉素的DMEM/F-12培养基中培养1周,每2天补充一次20ng/mL表皮生长因子(EGF;Invitrogen)、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF;Invitrogen)、2%B27(Invitrogen)和1%N2(Invitrogen)。

1.2.4 双荧光素酶报告试验

将经qRT-PCR扩增的含有miR-425-5p结合位点的LINC-PINT全长插入到pGL3载体(Promega,Madison,WI)中。以200ngmiRNA、200ng含全长LINC-PINT的pGL3萤火虫荧光素酶、20ngpGL3Renilla荧光素酶作为对照,在4×104个HEp-2细胞中进行共转染。以空载体pGL3作为阴性对照。转染6小时后补充培养基,48小时后用双荧光素酶报告分析系统(Promega)测定荧光素酶活性。

1.2.5 蛋白质印记检测

参照文献[12]进行蛋白质印记检测。培养的HEp-2细胞在添加蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法裂解缓冲液(Beyotime,Beijing,China)中收获。细胞裂解产物离心,悬液中的蛋白质用bichinconinicacid分析试剂盒(Beyotime)定量。蛋白质在凝胶上分离,然后转移到硝酸纤维素膜上。对PTCH1、Sox-2、CD44、CD133和Nanog(SantaCruz,CA)进行了检测。使用GAPDH作为对照,抗体购自Abcam(Cambridge,MA)。在摇摆条件下,抗体稀释度为1∶1000,4℃孵育过夜。孵育后,用缓冲液清洗膜,并与使用辣根过氧化物酶连接的二级抗体孵育,显影斑点,使用增强化学发光检测试剂盒(Beyotime)检测信号。

1.3 统计学方法

结果用独立实验的平均值表示,每个实验的总数都有描述。平均数的差异使用双尾非配对学生t检验进行评估,P<0.05为差异有统计学意义。对于多重比较,使用Benjamini-Hochberg方法来控制错误率。对于图形表示,误差条表示至少三个独立实验的最小标准偏差。


2、结果


2.1 LINC-PINT在喉癌组织中的表达及其对喉癌细胞干性的影响

为了评价LINC-PINT的表达对喉癌发生的影响,首先用qRT-PCR方法检测了LINC-PINT在喉癌组织和癌旁组织中折叠表达的变化。在选择的24对配对样本中,我们发现LINC-PINT在喉癌组织中的表达显著减少(P<0.001,图1A)。为了进一步确定LINC-PINT在诱导喉癌细胞干性中的作用,再次利用qRT-PCR技术评估了亲代HEp-2细胞和干细胞富集的HEp-2球体之间的基因表达水平。与亲本HEp-2细胞相比,LINC-PINT在干细胞球体中表达显著降低(P<0.01,图1B)。qRT-PCR证实了癌细胞干性与LINC-PINT的关联,HEp-2干细胞球体中干性相关基因(Sox-2、CD44、CD133和Nanog)的表达比亲本细胞中的表达增加也证实了这一点(图1C)。通过蛋白质印迹分析进一步证实了干性相关基因表达谱的变化(图1D)。为了确定LINC-PINT在喉癌细胞生长发育中的作用,转染含有LINC-PINT的基因载体(质粒),在HEp-2细胞中过表达LINC-PINT并通过qRT-PCR确定转染后LINC-PINT的表达水平。用qRT-PCR证实了干性相关基因Sox-2、CD44、CD133和Nanog的表达减少(图1E),用Westernblot证实了相应的蛋白表达减少(图1F)。因此,我们的结果提示,LINC-PINT可能通过抑制癌细胞的干性而抑制喉癌的发生。

2.2 LINC-PINT负调控miR-425-5p的表达

为了解LINC-PINT的分子靶标,我们使用了Diana工具(www.microrna.gr)。Diana工具预测到miR-425-5p与LINC-PINT在多个位点相结合。我们采用qRT-PCR方法检测喉癌组织中LINC-PINT和miR-425-5p之间的相关性。结果发现,内源性LINC-PINT负调控miR-425-5p表达(图2A)。为了确定miR-425-5p是LINC-PINT的分子靶点,我们评估了miR-425-5p在过表达LINC-PINT的HEp-2细胞中的表达水平(图2B)。将全长LINC-PINT克隆到荧光素酶报告基因中后,与miR对照相比,当miR-425-5p过表达时,荧光素酶活性下降到40%(图2C)。因此,我们认为miR-425-5p是LINC-PINT的分子靶点。

2.3 miR-425-5p增强喉癌细胞干性

与亲本细胞相比,miR-425-5p在HEp-2干细胞富集球中过表达(图3A)。进一步通过miR-425-5p-in转染降低miR-425-5p的表达,以探讨miR-425-5p在喉癌中的作用。用qRT-PCR证实miR-425-5p的表达降低(图3B),与干性相关基因的表达显著降低有关(图3C),通过Westernblot进一步证实了蛋白质表达的降低(图3D)。结果提示,抑制miR-425-5p可以降低喉癌细胞的干性。

2.4 miR-425-5p负调控PTCH1的表达

我们使用Diana工具预测到miR-425-5p的分子靶点为PTCH1。采用qRT-PCR方法验证了PTCH1与miR-425-5p的关系。我们发现miR-425-5p的内源表达负调控PTCH1(图4A)。此外,miR-425-5p在HEp-2细胞中的过表达降低了PTCH1的mRNA和蛋白质水平(图4B-C)。我们将PTCH1的3'-非翻译区(3'-UTR)克隆到荧光素酶报告基因中。与miR对照相比,miR-425-5p过表达组中PTCH1的3'-UTR的荧光素酶活性降低了60%(图4D)。总体而言,我们认为miR-425-5p负调控PTCH1的表达。

2.5 LINC-PINT调控miR-425-5p/PTCH1轴

通过实验证据推测出LINC-PINT通过miR-425-5p调控PTCH1的表达。分析PTCH1与LINC-PINT和miR-425-5p之间mRNA和蛋白表达的关系,发现LINC-PINT的过表达与PTCH1表达的显著增加有关,而miR-425-5p的过表达部分恢复了LINC-PINT上调引起的PTCH1表达上调(图5)。因此认为LINC-PINT可能调控miR-425-5p/PTCH1轴。


3、讨论


转录谱分析可以识别许多在正常组织和喉癌组织中差异表达的基因[13,14]。一项研究表明LINC-PINT在乳腺癌、子宫内膜癌和肺鳞状细胞癌等组织中均显著下调[15]。本研究中我们发现喉癌组织及干细胞富集球中LINC-PINT表达下调,这与在其他类型癌症中的发现高度一致[2,15]。

通过检测干性相关基因Sox-2、CD44、CD133和Nanog表达谱进一步证实体外培养的HEp-2肿瘤细胞干性,本研究结果显示:LINC-PINT的过表达会导致这些基因和相应蛋白质的表达下调。通过TAKAHASHI和YAMANAKA的开创性工作,已将这四种蛋白表征为细胞干性的标记[16]。因此,癌细胞可能通过下调或沉默lncRNA(例如LINC-PINT)来调节其干性。

为了评估LINC-PINT在癌组织中是如何协调并产生作用的。我们通过生物信息学分析LINC-PINT的miRNA靶标,通过查找全球数据库,发现miR-425-5p可以在三个不同的位点与LINC-PINT结合,且miR-425-5p受LINC-PINT的负调控。

PTCH1是Hedgehog途径的肿瘤抑制蛋白。在典型Hedgehog途径中,PTCH1抑制G蛋白偶联受体平滑肌受体(SMO)的活性,而转录因子胶质瘤相关癌基因(GLI)通过与融合抑制因子(SUFU)结合而失活。Hh配体与PTCH1结合可使PTCH1解除对SMO的抑制,从而激活GLI,进而可能自动诱导GLI和PTCH1[17]。GLI作为信号通路中的效应子,可直接调控多种靶基因的转录表达,如Sox-2、Nanog和CD133[18]。因此,沉默LINC-PINT很可能导致miR-425-5p的上调,而miR-425-5p反过来又可能在表观遗传上沉默PTCH1,导致GLI下游激活减少,从而降低了干性相关基因如Sox-2和Nanog的活性。

综述所述,本研究初步证实了LINC-PINT通过miR-425-5p/PTCH1轴在喉癌中可调控细胞干性。我们认为LINC-PINT和miR-425-5p可作为喉癌诊断的潜在生物标志物,LINC-PINT在喉癌发生发展中起抑制作用,miR-425-5p起促进作用;但是对其作用的评估需要用喉癌不同阶段的样本和不同的治疗方式进行进一步的测试和研究。


文章来源:于凭洋,苑振楠,孙冀.lncRNALINC-PINT通过miR-425-5p/PTCH1轴调节喉癌细胞干性[J].现代肿瘤医学,2022,30(01):6-10.

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