儿茶酚胺（CAs）是体内重要的生物胺，在肾上腺髓质、交感神经系统和大脑中产生和释放，作为神经递质或激素发挥作用，包括多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）和肾上腺素（E）［1］。CAs在肝脏中通过儿茶酚胺-O-甲基转移酶分别代谢为3-甲氧基酪胺（3-MT）、去甲变肾上腺素（NMN）和变肾上腺素（MN）［2］。CAs在调节心血管功能、应激反应和代谢等方面发挥关键作用，其体内水平可反映身体的健康状况［3-5］。除自身分泌外，CAs可通过外源性摄入，国内外报道了多起因注射E致使中毒甚至死亡的案事件，包括医疗事故、自杀和他杀等［6-8］。然而E入体代谢迅速［9］，静脉注射t1/2为2 min，因而隐蔽性强，过量摄入不易察觉，已成为高知犯罪的新兴手段。

CAs及其代谢物分子小、极性大、结构相近（结构式见图1），加之生物液体基质复杂，检测难度大。文献报道的前处理方法包括蛋白沉淀法（PP）［10］、液液萃取法（LLE）［11］和固相萃取法（SPE）［12-13］等。检测方法主要有液相色谱（LC）结合电化学检测器（ECD）［14］、荧光检测器（FLD）［15］以及质谱（MS）［16］。其中超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）灵敏度高、特异性好，是检测生物液体中CAs及其代谢物的主要方法［17-18］。国内外现有方法主要集中在血浆、尿液和脑脊液等样本的检测［11，19-20］，难以适用于司法鉴定中常见的血液样本。由于血液样本基质复杂且干扰物多，现有方法难以满足鉴定要求。因此，急需开发一种应用于血液样本中CAs及其代谢物的高效检测方法。

本文建立了一种SPE结合UPLC-MS/MS同时检测血液中CAs和上述3种代谢物的方法。该方法不仅可为临床诊断提供技术支持，还能有效应用于疑似E过量摄入致死案件中E及其上下游物质的检测，为相关案件排查和侦破提供技术手段，具有重要的实践意义。

图1 6种儿茶酚胺及代谢物的化学结构

1、实验部分

1. 1　仪器、试剂与材料　

1. 1. 1　仪器设备　

超高效液相色谱-串联质谱仪（Acquity UPLC Xevo TQ-xs MS，美国Waters公司）；BP210s电子天平（德国Sartorius公司）；Biofuge PRIMOR高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Vortex Genie-2涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；Milli-Q纯水系统（美国Millipore公司）；正压-96孔处理器（美国Waters公司）。

1. 1. 2　试　剂　

甲醇、乙腈（美国Thermo Fisher Scientific公司）为色谱纯；甲酸（上海麦克林生化科技有限公司）、L-抗坏血酸（上海易恩化学技术有限公司）为分析纯；实验用水为超纯水，由Millipore纯水机制得。去甲肾上腺素、肾上腺素、去甲变肾上腺素盐酸盐、多巴胺盐酸盐、变肾上腺素盐酸盐和3-甲氧基酪胺及对应的同位素内标：去甲肾上腺素-D（6 NE-D6）盐酸盐、肾上腺素-D（6 E-D6）、去甲变肾上腺素-D（3 NMN-D3）盐酸盐、多巴胺-D（4 DA-D4）盐酸盐、变肾上腺素-D（3 MN-D3）盐酸盐和3-甲氧基酪胺-D4（3-MT-D4）盐酸盐（质量浓度：100μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司）。

1. 1. 3　实验样品　

血液样品来自健康志愿者。对不同来源的血样进行检测，6种目标化合物含量均低于本方法检出限，可作为空白样品使用。

1. 2　标准储备溶液配制　

用含0. 1%抗坏血酸的甲醇将CAs及其代谢物配制成质量浓度为1μg/mL的混合标准储备液。内标以同法制备质量浓度为200 ng/mL的混合内标储备液，使用时以超纯水直接稀释100倍得到内标工作溶液。所有标准储备液均分装在1 mL棕色小瓶中，于-20℃保存。

1. 3　分析条件　

1. 3. 1　色谱条件　

色谱柱：ACQUITY UPLC® HSS PFP（2. 1 mm×100 mm，1. 8μm）；柱温：35℃；流动相A：0. 1%甲酸水溶液，B：乙腈。梯度洗脱：0. 0~1. 0 min，5% B；1. 0~2. 5 min，5%~15% B；2. 5~3. 5 min，15%~90% B；3. 5~4. 0 min，90% B；4. 0~4. 5 min，90%~5% B。流速：0. 4 mL/min；运行时间：4. 5 min；样品室温度：20℃；进样量：5μL。

1. 3. 2　质谱条件　

采用电喷雾电离正离子扫描模式（ESI+），多反应监测（MRM）模式检测，毛细管电压为0. 5 kV，脱溶剂气温度为550℃，脱溶剂气流速为1 000 L/h，锥孔气流速为150 L/h。6种化合物及对应内标的定性离子、定量离子、锥孔电压、碰撞能量见表1。

表1 6种化合物及对应内标的质谱参数

1. 3. 3　前处理方法　

移取血液样品100μL，加入100μL混合内标工作溶液、500μL水，涡旋混匀30s，用离心机以12 000 r/min离心5 min，取上清液转移至超滤离心管（Amicon®Ultra-4 mL-3k，美国Millipore公司），以8 000 r/min离心15 min，收集接收管滤液待用。将96孔固相萃取板（Oasis WCXμElution SPE，美国Waters公司）依次用200μL乙腈、200μL水进行预处理，转移上述待处理样本分两次上样，以200μL水、200μL乙腈依次淋洗，再以50μL 85%乙腈水溶液（含1%甲酸）洗脱目标化合物，用700μL 96孔圆孔样品接收板（美国Waters公司）收集洗脱液。在正压装置氮气下将洗脱液吹至近干，用100μL水复溶，取5μL进行UPLC-MS/MS分析。

2、结果与讨论

2. 1　质谱条件优化　

依据目标物的化学电离特性，选择电喷雾离子源正离子模式进行检测。取100 ng/mL标准溶液采用流动注射直接进样，以全扫描方式确定目标化合物的母离子，通过碰撞反应进行子离子扫描，选择响应信号较高的离子对作为定量和定性离子对。同时优化锥孔电压、碰撞能量等质谱参数，结果见表1。

2. 2　色谱条件优化　

2. 2. 1　色谱柱的选择　

6种化合物的极性大，采用一般的C18色谱柱难以实现对目标物的保留。考察了ACQUITY UPLC® HSS PFP（100 mm×2. 1 mm，1. 8μm）、ACQUITY UPLC® HSS T3（100 mm×2. 1 mm，1. 8μm）、ACQUITY UPLC® BEH Amide（100 mm×2. 1 mm，1. 7μm）3种色谱柱的分离效果。结果表明，HSS T3色谱柱对目标物的保留时间过短，分离度不足且峰形宽大；HSS PFP和BEH Amide色谱柱均能够分离6种目标物，但HSS PFP色谱柱峰形更尖锐、响应值更高，因此本方法选择HSS PFP色谱柱分离待测物。

2. 2. 2　流动相的优化　

CAs及其代谢物均含有氨基，呈弱碱性，流动相中加入甲酸有利于提高离子化效率。考察了乙腈-0. 1%甲酸水溶液和甲醇-0. 1%甲酸水溶液分别为流动相时6种待测组分的分离情况。对比发现，6种分析物在乙腈-0. 1%甲酸水溶液流动相体系中的分离度和灵敏度更佳。此外，实验还探讨了分别向0. 1%甲酸水溶液中加入2 mmol/L和5mmol/L甲酸铵对分析物峰形的影响，发现水相添加甲酸铵时待测物的保留时间相对靠前，响应值降低。因此，最终选择乙腈-0. 1%甲酸水溶液作为流动相，该条件下6种目标物的色谱图见图2。

2. 3　前处理优化　

2. 3. 1　提取液的优化　

油水分配系数（logP）用于评估物质的亲脂性和亲水性，通常logP值小于0的化合物具有较强的亲水性。CAs及其代谢物的logP值在-1. 85~-0. 08之间，表明该类物质的水溶性好，考虑到实验后续使用固相萃取柱，选择纯水作为血液样本的提取液。由于血液中含有大量生物大分子物质，适当稀释血样可降低其粘度，防止堵塞超滤膜，避免干扰目标物的分离。考察了血样与水溶液不同体积比（1∶4、1∶6、1∶8）时6种目标物提取效率的变化情况。结果表明，当体积比由1∶4增至1∶6时，各物质的回收率均提高，稳定在68. 9%~95. 0%之间，进一步增加体积比至1∶8，E和DA的回收率从77. 5%和73. 9%分别降至72. 1%和67. 5%，其余化合物的回收率变化较小。为保证提取效果，实验采用样品与水溶液的体积比为1∶6。

2. 3. 2　超滤离心管的选择　

超滤离心管利用特定孔径的滤膜截留大于某一分子量的物质，小于该分子量的物质则通过膜孔进入下方的接收管。血液含有大量蛋白质等大分子成分，而6种目标物的分子量在150~200之间，可利用超滤管透析出小分子目标物以实现对血样的初步净化。准备空白血6份，按体积比1∶4加入水溶液，离心取上清液，选取3份直接过固相萃取柱，另外3份经超滤离心管净化再过柱，依照后续实验步骤处理，氮吹至近干后加入10 ng/mL混合标准溶液复溶并分析样品。结果显示，经超滤管净化处理后的样液澄清透明，与未处理样本的检测结果相比干扰减少，基质效应升高了20. 1%~32. 5%（见图3）。因此，实验选择在固相萃取前对血样进行超滤处理，以达到初步净化目的。

2. 3. 3 SPE柱类型的选择　

6种化合物的酸解离常数pKa为8. 53~9. 57，可以有效地被离子交换柱保留。考察了Oasis WCX（30 mg）和96孔Oasis WCX（2 mg）2种固相萃取柱的回收效果。选取6份10 ng/mL的加标样品，经上样和洗脱处理后进行检测。如图4所示，96孔Oa‐sis WCX柱对6种目标物的选择性较高，平均回收率为70. 2%~99. 7%，满足分析需求。因此实验选择96孔Oasis WCX固相萃取柱进行净化提取。

2. 3. 4　洗脱溶剂的优化　

CAs及其代谢物均含有氨基，为弱碱性化合物，依据SPE柱离子交换原理，应采用酸性溶液洗脱。比较了含1%甲酸的不同体积分数乙腈水溶液（70%、85%、100%）的洗脱效果。结果表明，采用1%甲酸乙腈进行洗脱时6种待测物的回收率为70. 2%~99. 7%；当乙腈体积分数为85%时，各物质的回收率稳定在77. 2%~104%范围内；当乙腈体积分数降至70%时，E、NMN、MN和3-MT的回收率显著降低，6种化合物的回收率为76. 3%~98. 6%。采用85%乙腈水溶液（含1%甲酸）洗脱的回收效果最佳，因此选其为洗脱溶剂。

图2 6种目标物的UPLC-MS/MS选择离子流色谱图

图3 6种目标物在不同前处理条件下的基质效应

图4 2种固相萃取柱提取血液中6种分析物的回收率

2. 4　基质效应　

随机选取6份不同来源的空白血样，每份制备18个平行样品，按照“1. 3. 3”进行前处理，氮吹至近干后分别加入低、中、高3个浓度的混合标准溶液复溶。在相同的3种浓度下，每个水平制备6份混合标准溶液。将上述样品和标准溶液上机检测，通过下式计算基质效应：基质效应（%）=提取后加标样品峰面积/标准溶液峰面积×100%，结果见表2。6种目标化合物的基质效应为86. 2%~102%，相对标准偏差（RSD）为3. 3%~9. 7%，表明血液基质对CAs及其代谢物的测定结果无明显影响，满足检测要求。

表2 6种目标物在血液中的基质效应与相对标准偏差

2. 5　线性关系、检出限与定量下限　

取“1. 2”配制的6种儿茶酚胺类物质混标储备液加入空白血样中，配制成0. 5~50 ng/mL的系列浓度样品，按“1. 3. 3”进行样品预处理后上机测定。采用内标法定量，以各目标物与对应内标的峰面积比值为纵坐标（Y），目标物的质量浓度为横坐标（X）进行线性拟合。结果显示，6种化合物在0. 5~50 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数（r2）大于0. 99。空白样品中添加0. 5 ng/mL的混标溶液，经前处理后进样检测，分别以定量离子对3倍和10倍信噪比（S/N）时响应值对应的质量浓度确定检出限（LOD）和定量下限（LOQ），各目标化合物的LOD为0. 2 ng/mL，LOQ为0. 5 ng/mL（见表3）。

表3 6种目标物在血液中的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量下限

2. 6　回收率及相对标准偏差　

空白血样在提取前后分别添加低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，每个浓度制备6个平行样品，按实验条件进样检测。通过公式：回收率（%）=提取前加标样品峰面积/提取后加标样品峰面积×100%计算该方法的回收率。3个浓度水平的加标样品于1 d内进行3次重复检测，同法操作连续3 d进样检测，计算日内、日间RSD。由表4可见，本方法的回收率为68. 9%~101%，RSD为2. 3%~10%，表明所建方法的准确度和精密度较好。

表4 6种目标物在血液中的回收率及相对标准偏差

2. 7　稳定性　

为探究处理后样品的稳定性，配制1、10、50 ng/mL 3个质量浓度的加标样品，按“1. 3. 3”方法处理后分别置于20℃自动进样盘和-20℃冰箱冷冻保存，分别于0、4、8、12、24 h进样测定，结果见图5。经前处理后的样品放置在20℃条件下，3种CAs物质在4 h内相对稳定，8 h后降解了24. 3%~31. 7%；3种代谢物在8 h内相对稳定，12 h后降解了15. 9%~21. 7%。放置在-20℃条件下，6种物质在24 h内相对稳定。综上，样品处理后应尽快检测，否则需置于-20℃冰箱中冷冻保存。

图5　不同储存条件下各处理后样品组中6种目标物的稳定性

2. 8　案例应用　

2024年4月邱某报警称其侄子死于家中，具体情况不详。民警到场后发现死者躺在床上，手臂有刀刻花纹，血迹不明显。现场有白色晶体，利多卡因注射液空瓶1个，肾上腺素注射液空瓶1个。警方后续提取检材送检，采用本方法在心脏血液及肾上腺素注射液空瓶中均检出E；血液中未检出DA，NE、E、NMN、MN、3-MT的质量浓度分别为17. 8、29. 9、154. 0、17. 9、1. 5 ng/mL。结果表明，本方法可应用于实际案例的检测。

据文献报道，健康个体血浆中内源性E的正常水平参考值为13. 0~173. 8 pg/mL［21-23］，而在死后血液中E水平有不同程度的升高。Lee等［24］研究了114份法医尸检血样，不同时间取血，无E注射史的死亡案例心脏血液中E的质量浓度为2. 1~329. 2 ng/mL，有E注射史的质量浓度为11. 9~537. 1 ng/mL。明确因注射E中毒致死的案例［7-8］，血样中E的质量浓度为12~91 ng/mL，现有文献表明死后血液中E浓度不能作为E中毒的标志物进行应用。有研究表明CAs代谢物的半衰期长，在血液中较为稳定［25］，Yaworsky等［26］通过探究E给药组与对照组兔血浆中的MN和NMN水平，提出将浓度比值CMN/CNMN作为预测外源性E摄入的指标，为肾上腺素中毒的相关研究提供了新方向。

3、结论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱同时检测血液中CAs及其3种代谢物的方法，填补了我国司法鉴定领域在血液中上述物质检测方面的空白。与传统的SPE相比，本方法前处理流程加入超滤净化步骤，显著降低了血液样本的基质抑制效应，且可实现高通量处理。该方法具有样品用量少、特异性强、灵敏度高等特点，能够应用于实际血液样品的检测，可为临床诊断、肾上腺素中毒案件的检测提供有力的技术支持。

基金资助:国家重点研发计划项目(2023YFC3303904);

文章来源:金珊珊,常靖,吴世豪,等.UPLC-MS/MS法同时测定血液中儿茶酚胺及其代谢物[J].分析测试学报,2025,44(07):1378-1384.