氟喹诺酮类抗生素是一类人工合成的广谱抗生素，其抗菌活性强、价格低，被广泛用于动物养殖中，若被长期使用，即使是低剂量，也易造成动物源食品中该抗生素的残留。残留的抗生素可通过食物链进入人体，引起一些不良反应，主要对肌肉、肌腱、骨骼和神经系统产生危害[1]，甚至有致癌、致畸、致突变的风险。

食品分析检测技术是保障食品安全的重要手段。因为食品基质复杂，氟喹诺酮类抗生素残留浓度低，大部分检测技术，如液相色谱、高效液相色谱、及高效液相色谱-质谱等[2,3,4]，在检测实际样品前需要对目标物进行富集分离，排除基质干扰，以提高检测的灵敏度和准确性。常用的富集分离方法如液液萃取、固相萃取和固相微萃取等技术，这些方法通常存在操作复杂、耗时长、有机溶剂用量大等缺点[5,6,7,8,9,10]。

分子印迹技术是使模板分子与功能单体以共价键或非共价键结合，再通过聚合作用形成包覆配合物的立体结构，经过洗脱解离模板分子后，形成与模板分子空间构型相匹配的印迹孔穴，可对模板分子进行特异性识别和吸附[11,12]。而磁分子印迹纳米粒子兼具特异性和磁性，在选择性吸附目标物的同时可通过外加磁场快速与基质分离，具有制备简单、成本低廉、特异性强、可重复利用等优点[13,14,15]。

本研究以诺氟沙星为模板分子，利用多巴胺在室温（25℃）弱碱性溶液中可进行氧化自聚合的性质，在氨基修饰的四氧化三铁纳米粒子表面合成了MMIPsNPs，其制备条件温和、耗时短、试剂用量少，制备的MMIPsNPs能被磁铁迅速吸附，为富集分离样品中的NOR及其后续检测提供了一种更简单、环保的新技术。

1、材料与方法

1.1试剂

NOR、环丙沙星、四环素标准品：上海源叶生物有限公司；磺胺嘧啶标准品：上海瑞永生物科技有限公司；六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亚铁（FeCl2·4H2O）、乙酸：上海国药集团化学试剂有限公司；DA、四甲基氢氧化铵、3-氨丙基三乙氧基硅烷：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris-base：美国VWRInternational有限公司。

1.2仪器与设备

MultiskanGO1510全波长酶标仪：芬兰ThermoFisherScientificOy公司；DZF-6030A真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；KQ-100超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；HNY-20017恒温摇床：天津欧诺仪器仪表有限公司。

1.3试验方法

1.3.1Fe3O4@NH2NPs的制备

将10mmolFeCl2·4H2O、18.5mmolFeCl3·6H2O溶于100mL超纯水中，通氮除氧，水浴加热至85℃，滴加40mL2mol/LNaOH溶液，在550r/min转速下反应1h，冷却至25℃后用磁铁吸附，再用超纯水反复冲洗至中性后真空干燥，黑色固体即为Fe3O4NPs。干燥后的Fe3O4NPs，经7%TMAOH活化后，用乙醇清洗5次。将0.8g活化的Fe3O4NPs加入120mL体积比为1∶1的乙醇-水溶液中混合均匀，水浴加热至40℃再加入3mLAPTES，通氮除氧，在350r/min条件下反应10h，冷却至25℃后用磁铁吸附，乙醇冲洗5次，60℃真空干燥，于4℃冰箱中保存备用。

1.3.2MMIPsNPs的制备

1.3.2.1NOR检测波长的确定

分别对Fe3O4@NH2NPs、NOR、DA，用酶标仪扫描紫外全波段光谱，确定NOR的最佳检测波长。

1.3.2.2MMIPsNPs的制备

将500mg的Fe3O4@NH2NPs加入100mL体积比为1∶1的乙醇-水溶液（用Tris-HCl调节pH值至8.5）中搅拌均匀，转移至250mL的烧瓶，25℃水浴，依次加入15mgNOR、134mgDA搅拌均匀，在300r/min转速下反应2h，用磁铁吸附固体，纯水清洗固体3次后用真空干燥。

1.3.2.3NOR洗脱液的选择

分别用1mmol/LNaOH、1mol/LNaOH、体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液、体积比为97:3的乙醇-乙酸溶液与1mol/LNaOH交替洗脱4种方法洗脱模板分子，各洗脱5次，再用纯水清洗3次。取20mgMMIPsNPs吸附1mL0.1mg/mL的NOR标准溶液2h，检测上清液中NOR的残留量，考察洗脱液洗脱模板分子的能力，及MMIPsNPs再次吸附NOR的效果。

1.3.2.4模板分子与功能单体物质的量比的确定

按照1.3.2.2的条件，固定Fe3O4@NH2NPs(500mg）和NOR(15mg）的添加量，改变NOR与DA物质的量比（NOR∶DA=1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）制备MMIPsNPs。取15mgMMIPsNPs吸附1mL0.1mg/mL的NOR标准溶液2h，检测上清液中NOR的残留量，计算其吸附效率，确定最佳的NOR与DA物质的量比例。

1.3.2.5Fe3O4@NH2NPs添加量的确定

按照1.3.2.4得到的最佳条件，固定NOR和DA的添加量，改变Fe3O4@NH2NPs的添加量（250、500、750mg），制备MMIPsNPs。取一定量的MMIPsNPs吸附1mL0.1mg/mL的NOR标准溶液2h，检测上清液中NOR的残留量，计算其吸附效率，确定Fe3O4@NH2NPs的最佳添加量。

1.4吸附时间对吸附效率的影响

准确称取9份4mgMMIPsNPs于4mL离心管中，分别加入1mL0.02mg/mL的NOR标准溶液，于恒温培养振荡器中吸附，在吸附10、20、30、40、50、60、80、100、120min时取出，磁铁吸附后取上清液，检测其NOR的残留量，计算其吸附效率，考察吸附时间对吸附效率的影响。

1.5MMIPsNPs用量对吸附效率的影响

分别准确称取4、10、15、20mg的MMIPsNPs于4mL离心管，分别加入1mL0.1mg/mL的NOR标准溶液，于恒温培养振荡器中吸附120min，磁铁吸附后取上清液，检测其NOR的残留量，计算其吸附效率。考察MMIPsNPs用量对吸附效率的影响。

2、结果与分析

2.1Fe3O4@NH2NPs的制备

2.1.1Fe3O4@NH2NPs的制备及稳定性

制备的Fe3O4NPs和Fe3O4@NH2NPs呈黑色，在外加磁场作用下可快速聚集，具有良好的磁性。120℃热风干燥时，Fe3O4NPs的颜色由黑色变为红褐色，说明其完全被氧化；而Fe3O4@NH2NPs仍为黑色，未发生氧化。故氨基修饰能有效保护Fe3O4NPs不被氧化。

2.1.2Fe3O4NPs活化时间的确定

制备的Fe3O4NPs表面只有极少量的-OH，经TMAOH活化后可在其表面形成更多的-OH，而-OH的含量影响后续的氨基修饰过程[16]。根据文献[17]的方法测定了Fe3O4@NH2NPs表面氨基含量，即取20mgFe3O4@NH2NPs，加入10mL0.1mol/L的HCl标准溶液，超声振荡均匀，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，记录滴定终点时消耗NaOH的体积，计算Fe3O4@NH2NPs表面氨基的含量。活化时间对Fe3O4@NH2NPs表面氨基含量的影响如图1所示。

图1活化不同时间制备的Fe3O4@NH2NPs表面氨基含量

结果表明，Fe3O4NPs活化2h后制备的Fe3O4@NH2NPs，其表面氨基含量为0.1225mmol/g，已达平衡，相对于未经活化制备的Fe3O4@NH2NPs的表面氨基含量（0.0683mmol/g）增加了约79%，故Fe3O4NPs的活化时间为2h。

2.2MMIPsNPs的制备

2.2.1检测波长的确定

图2为Fe3O4@NH2NPs、NOR、DA和NaOH的紫外光谱图。Fe3O4@NH2NPs和NaOH无明显紫外吸收。DA在285nm处有吸收峰，而NOR在285、323、335nm处均出现了明显的吸收峰，且323nm处的吸收峰比335nm更强。故NOR的检测波长选择323nm。

图2NOR、DA、Fe3O4@NH2NPs及NaOH的紫外光谱

2.2.2MMIPsNPs对NOR吸附效率的计算

配置0.004mg/mL～0.1mg/mL的NOR标准溶液，在323nm处检测其吸光度值，建立NOR标准曲线，见图3。

图3不同浓度NOR的紫外光谱

取MMIPsNPs富集分离NOR后的上清液，在323nm处测其吸光度值，根据标准曲线计算上清液残留的NOR浓度，即可计算MMIPsNPs对NOR的吸附效率，公式如下：

式中：C0为吸附前NOR的初始浓度，mg/mL;C为吸附后上清液中残留的NOR浓度，mg/mL。

2.2.3NOR洗脱液的确定

4种洗脱方式洗脱的20mgMMIPsNPs，吸附1mL0.1mg/mLNOR标准溶液2h的吸附效率见图4。

图44种洗脱方式下的MMIPsNPs对NOR的吸附效率

横轴1～4分别表示洗脱液为1mmol/LNaOH、1mol/LNaOH、体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液、体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液与1mmol/LNaOH交替洗脱。

由图4可知，采用体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液作为洗脱液，其吸附效率最高，为88.79%，用体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液与1mmol/LNaOH交替洗脱，其吸附效率为85.37%,1mol/LNaOH的洗脱效果最差，为39.38%。故优选体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液作为模板分子的洗脱液。

2.2.4模板分子与功能单体物质的量比的确定

模板分子与功能单体不同物质的量比制备的MMIPsNPs，对NOR的吸附效率见图5。

图5不同模板分子与功能单体物质的量比制备的MMIPsNPs对NOR的吸附效率

由图5可知，随着DA的量逐渐增大，吸附效率逐渐增加，这可能是由于DA的增加，形成的分子印迹孔穴的数量增加。当NOR和DA的物质的量比为1∶15时，吸附效率最大，为99.17%，相对标准偏差为1.03%。当NOR和DA的物质的量比为1∶20时，吸附效率减小至96.91%，这可能是因为DA的用量过多导致分子印迹层变厚，掩盖了部分分子印迹孔穴[18,19]。故模板分子与功能单体的最佳物质的量比为1∶15。

2.2.5Fe3O4@NH2NPs添加量的确定

不同Fe3O4@NH2NPs添加量制备的MMIPsNPs，对NOR的吸附效率见图6。

图6不同Fe3O4@NH2NPs添加量制备的MMIPsNPs对NOR的吸附效率

由图6可知，分别取4、10、15mg的MMIPsNPs进行吸附时，Fe3O4@NH2的添加量为500mg制备的MMIPsNPs的吸附效率分别为55.24%、94.23%、99.17%，而Fe3O4@NH2NPs的添加量为250mg和750mg制备的MMIPsNPs均没有Fe3O4@NH2的添加量为500mg制备的MMIPsNPs的吸附效率高，可能原因是250mg的Fe3O4@NH2NPs的添加量过少，导致形成的分子印迹层较厚，从而掩盖了部分分子印迹孔穴，最终使得吸附效率下降。而750mg的Fe3O4@NH2NPs的添加量过多，部分Fe3O4@NH2NPs表面没有完全形成分子印迹层，使得吸附效率下降。故Fe3O4@NH2NPs的最佳添加量为500mg。

2.2.6MMIPsNPs的最佳制备方法

称取500mgFe3O4@NH2NPs加入100mL体积比为1∶1的乙醇-水溶液（含10mmol/LTris-HCl,pH8.5）超声溶解10min后加入15mgNOR搅拌10min，再加入134mgDA（稍过量）混合。25℃水浴，300r/min机械搅拌反应2h。反应停止后，静置2h。用磁铁对其进行富集分离后，用水和体积比为97∶3的乙醇-乙酸溶液洗涤后真空干燥，得到MMIPsNPs。磁性非分子印迹纳米粒子（MNIPsNPs）的制备除不添加模板分子外，其他条件与MMIPsNPs制备方法一致。

2.3吸附时间对吸附效率的影响

4mg的MMIPsNPs和MNIPsNPs分别对1mL0.02mg/mLNOR吸附效率随时间的变化如图7所示。

图7吸附时间对吸附效率的影响

由图7可知，相同条件下，随着吸附时间的增加，吸附效率不断上升，在60min时基本达到平衡，此时的吸附效率为94.61%，是MNIPsNPs(43.39%）的2.18倍，说明制备的MMIPsNPs具有能结合NOR的分子印迹孔穴。

2.4MMIPsNPs用量对吸附效率的影响

不同MMIPsNPs用量对0.1mgNOR的吸附效率如图8所示。

图8MMIPsNPs用量对吸附效率的影响

由图8可知，在吸附相同时间的情况下，吸附效率随着MMIPsNPs用量的增加而上升，在用量为15mg时基本达到平衡，此时吸附效率为99.17%，相对标准偏差为1.03%，基本已完全吸附。说明吸附相同质量的NOR,MMIPsNPs的用量越大，吸附效率越高。

3、结论

MMIPsNPs因其能够特异性识别和吸附样品中的目标物，并在外加磁场作用下可快速与基质分离，在分析检测领域得到了广泛地应用[12,20,21]。本研究首先采用化学共沉淀法制备了Fe3O4NPs，并发现用7%TMAOH对其活化2h，再进行氨基修饰能够使Fe3O4NPs表面氨基含量大大增加。然后以Fe3O4@NH2NPs为磁性载体、NOR为模板分子、DA为功能单体和交联剂，成功制备了NOR的MMIPsNPs。所制备的4mgMMIPsNPs吸附1mL0.02mg/mL的NOR60min，其吸附效率可达94.61%，是相同条件下MNIPsNPs的2.18倍。15mgMMIPsNPs吸附1mL0.1mg/mL的NOR60min，其吸附效率可达99.17%，相对标准偏差为1.03%，说明可通过调整MMIPsNPs用量实现对NOR的完全吸附。该制备方法简单、成本低廉，可快速有效富集分离NOR，且能重复利用，对简化样品前处理步骤、提升前处理效率、提高分析结果的准确性和重现性具有重要的实际意义。

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基金:国家自然科学基金(31671931､31601551).