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硝普钠干预下建立人软骨细胞凋亡模型

2025-08-14 32 上传者：管理员

摘要：目的通过确定硝普钠(SNP)在人软骨细胞中的适宜浓度及其作用时间，以建立一个有效的凋亡模型。方法采用不同浓度的SNP(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L)对人关节软骨细胞进行干预，并对其增殖、凋亡以及线粒体膜电位进行检测。结果与0 mmol/L相比，SNP浓度在0.5～1.0 mmol/L时细胞活力无显著降低；当SNP浓度在1.5～2.5 mmol/L时，细胞活力明显逐渐下降，有剂量依赖性；且随着时间推移各组细胞活力也逐渐下降。经浓度为1.5、2.0、2.5 mmol/L SNP干预引起的细胞凋亡现象明显，凋亡率上升。线粒体膜电位的分析表明，当SNP的浓度升高时，人关节软骨细胞膜电位相应降低。结论一定浓度的SNP干预下，能够有效地促进人关节软骨细胞凋亡，且随着SNP浓度的不断提高，细胞线粒体膜电位也会随之降低，表明采用一定浓度的SNP可有效地建立人软骨细胞凋亡模型。

关键词：
OA
人软骨细胞
硝普钠
退行性疾病
骨关节炎
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骨关节炎(OA)是一种退行性疾病,以关节软骨变性为基本特征,主要症状包括关节疼痛､畸形､屈伸功能减退[1]｡OA软骨变性主要是由于病理状态下软骨细胞自我修复能力显著下降,表现为软骨细胞活力低,凋亡率异常增高,最终软骨细胞代谢稳态失控或丧失[2]｡当软骨细胞肥大时,它们会老化并引发细胞凋亡和一系列软骨细胞外基质的降解[3]｡凋亡的软骨细胞常出现在软骨病变中,被认为是OA的信号[4]｡目前软骨细胞凋亡是研究热点,但其研究大多仅限于动物细胞,极少涉及人软骨细胞研究,且研究结果尚需进一步完善｡为促进OA的凋亡研究､研发防治药物及其机制的探索,亟需建立一合适的人软骨细胞凋亡模型｡一氧化氮(NO)可增强基质金属蛋白酶活性,减少白细胞介素⁃1受体拮抗剂的合成和促进细胞凋亡,与OA的发生发展密切相关｡硝普钠(SNP)被广泛用于细胞培养中产生NO的供体,本研究旨在确定SNP在人关节软骨细胞中的适宜剂量及其作用时间,以建立一个有效的凋亡模型｡

1、材料与方法

1.1人软骨组织来源纳入标准:①符合重度OA诊断并须行全膝关节置换治疗｡②年龄在65~80岁｡在西南医科大学附属中医医院骨关节科选取2例行全膝关节置换术的重度OA患者,均为男性,年龄分别为66､68岁｡职业为工人,病程均>5年｡所取软骨组织主要为术中截取的膝关节股骨内外侧髁负重区､胫骨的部分｡本研究经西南医科大学附属中医医院伦理委员会批准,患者均知情同意并签署知情同意书｡

1.2实验药品和试剂SNP(规格:100mg,剂型:粉剂,纯度:≥98.0%);胶原酶Ⅱ､4’,6⁃二脒基⁃2⁃苯基吲哚(DAPI)溶液､甲苯胺蓝染色液均为索莱宝公司产品;CollagenⅡAntibody(兔抗体)､荧光二抗均为Affinity公司产品;CCK⁃8试剂盒(APExBIO公司);凋亡试剂盒､JC⁃1线粒体膜电位检测试剂盒均为碧云天公司产品｡

1.3人软骨细胞制备与检测于手术室取得关节软骨组织,去掉血渍､滑膜､软骨下骨等组织,无菌情况下放于冰盒直接转运至细胞实验室,剪切至1mm3大小｡加入胰蛋白酶初步消化,胶原酶Ⅱ二次消化｡消化结束后200目滤网过滤,离心,重悬混匀,置于细胞培养箱中进行培养,倒置显微镜观察,根据细胞贴壁及培养液的情况,隔2~3d进行细胞换液,拍照并记录｡细胞以1×105个/ml的浓度接种于6孔板中,进行细胞爬片,放入细胞培养箱中培养2~3d,待倒置显微镜观察到盖玻片上软骨细胞汇合度达到80%以上,聚丁二酸丁二醇酯(PBS)清洗3次;4%多聚甲醛固定,PBS清洗3次,甲苯胺蓝染色20min,无水乙醇脱色｡同上一步骤行细胞爬片,待细胞融合率达80%以上,PBS清洗3次;4%多聚甲醛固定20min,PBS清洗3次;TritonX⁃100处理20min,PBS清洗3次｡加入5%山羊血清对人软骨细胞封闭40min,加入一抗Ⅱ型胶原抗体(抗体稀释度工作浓度为1∶200)孵育过夜,PBS清洗3次;滴加荧光二抗(1∶100)避光常温孵育1h,PBS清洗3次;使用DAPI溶液孵育5min,PBS清洗3遍;甘油封片,避光,荧光显微镜观察｡

1.4人软骨细胞活力检测细胞以1×105个/ml的浓度接种于96孔板中,细胞贴壁生长汇合度达到80%后,使用不含血清的培养基饥饿培养细胞12h｡分别用(0､0.5､1.0､1.5､2.0､2.5mmol/L)SNP处理细胞12､24､36h,每孔内滴加10μlCCK⁃8溶液,孵育2h,采用酶标仪检测吸光度(OD值)｡

1.5人软骨细胞凋亡检测细胞以1×105个/ml的浓度接种于6孔板中,待细胞生长汇合度达到80%以上时,饥饿处理12h后,替换含0､1.5､2.0､2.5mmol/LSNP的培养液处理12h,收集上清液及细胞,离心,去上清,PBS清洗2遍,使用凋亡检测试剂盒检测各组细胞凋亡率的变化｡加入195μl膜联蛋白V⁃异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ⁃FITC)结合液并移入流式管中,然后加入5μlAnnexinV⁃FITC染液和10μl碘化丙啶染液,混匀,室温避光孵育20min,流式细胞仪对各组细胞凋亡情况进行检测｡

1.6人软骨细胞线粒体膜电位检测细胞以1×105个/ml的浓度接种于12孔板中,待细胞生长汇合度达到80%以上,饥饿处理12h,替换含(0､1.5､2.0､2.5mmol/L)SNP的培养液处理12h｡加入检测线粒体膜电位的荧光探针JC⁃1染料(10mg/L),孵育20min,洗涤3次,荧光显微镜下观察｡

1.7统计学处理采用GraphpadPrism9.5.1软件进行统计学分析｡计量资料以xs表示,比较采用One⁃wayANOVA检验｡

2、结果

2.1人软骨细胞形态观察见图1､2｡人关节软骨消化下来的原代细胞培养1d后镜下可见较多圆形､半透明细胞及少量梭形细胞(见图1A);1周左右细胞贴壁生长约占培养瓶底部70%~80%,细胞大多呈长梭形改变(见图1B)｡甲苯胺蓝染色后,可见蓝紫色的颗粒状小点出现在软骨细胞内部以及周围,镜下见软骨细胞总体呈蓝色,胞质呈淡蓝色,胞核呈深蓝色(见图1C);荧光显微镜镜下可见经Ⅱ型胶原染色后细胞核呈蓝紫色,胞膜和胞质呈绿色(见图2)｡本研究所提取细胞经形态学观察､甲苯胺蓝染色及细胞免疫荧光染色观察鉴定为软骨细胞｡

图1人软骨细胞形态观察

图2荧光显微镜镜下可见经Ⅱ型胶原染色后细胞核呈蓝紫色,胞膜和胞质呈绿色

2.2SNP对人软骨细胞活力的影响见图3｡与0mmol/L相比,SNP浓度为0.5mmol/L时,干预12､24､36hOD值相对升高;浓度为1.0mmol/L时,干预12､24hOD值无明显降低,干预36hOD值下降,但下降幅度较小;浓度为1.5､2.0､2.5mmol/L时,OD值明显逐渐下降,且随着时间的推移OD值亦逐渐下降｡

图3不同浓度的SNP对人软骨细胞活力的影响

2.3SNP诱导人软骨细胞凋亡的检测见图4｡与0mmol/L相比,浓度为1.5､2.0､2.5mmol/L的SNP干预细胞12h后均发生明显凋亡,且凋亡都以晚期凋亡为主,比例相对逐渐上升;细胞早期凋亡比例相对逐渐下降,人软骨细胞的总凋亡率随浓度的增加而上升｡

2.4SNP对人软骨细胞线粒体膜电位的影响见图5｡与0mmol/L相比,浓度为1.5､2.0､2.5mmol/LSNP干预的人软骨细胞线粒体膜电位逐渐下降｡

3、讨论

软骨细胞是骨关节炎研究的一个重要热点,其增殖､凋亡等生理功能的改变可导致软骨功能状态的改变,因此,有效抑制软骨细胞凋亡对OA治疗具有重要意义[5-7]｡此外,OA患者关节软骨细胞可表现出胞外膜电位丧失､线粒体功能障碍等特点[8-9]｡因此,构建符合临床研究需求的软骨细胞凋亡模型,是促进防治OA药物开发的必要条件｡

图4不同浓度的SNP诱导人软骨细胞凋亡的结果

图5SNP对人软骨细胞线粒体膜电位影响的结果

本研究通过SNP对体外分离培养人软骨细胞进行诱导,使用CCK⁃8试剂盒检测软骨细胞活性并使用酶标仪检测OD值进行量化,使用AnnexinⅤ⁃FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况,并使用流式细胞仪量化,使用JC⁃1染料对细胞线粒体膜电位检测｡结果显示,0.5､1.0mmol/L的SNP干预细胞后其成活率与0mmol/LSNP相比无明显降低,故该浓度暂不适用于凋亡模型的构建｡与0mmol/L相比,1.5､2.0､2.5mmol/LSNP干预细胞后成活率明显降低,并随时间和浓度的增加,成活率下降｡通过流式细胞仪检测,当SNP浓度分别为1.5､2.0､2.5mmol/L时,细胞凋亡现象明显,线粒体膜电位亦逐渐下降,这表明细胞凋亡与线粒体膜电位之间存在着密切的联系｡

综上所述,通过一定浓度的SNP对人软骨细胞处理后,人软骨细胞活力下降,凋亡率增加;人软骨细胞线粒体膜电位降低｡本研究通过提取人关节软骨细胞,并通过一定浓度的SNP诱导能够有效地促进其凋亡,从而构建体外OA模型,更契合后期实验环境及目的;但未能完全阐述SNP诱导人软骨细胞凋亡的作用机制,若要明确治疗药物有效性,还需进一步相关分子实验｡

基金资助:四川省科技厅科技计划专项(编号:2022YFS0609);四川省泸州市政府—西南医科大学联合项目(编号:2021LZXNYD-J31);四川省中医药管理局科学技术研究专项(编号:2023MS446);西南医科大学校级科研项目(编号:2023ZYYJ05);

文章来源:尹路,蒋川锋,陈俊杰,等.硝普钠干预下建立人软骨细胞凋亡模型[J].临床骨科杂志,2025,28(04):588-591.