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PDZ结构域蛋白1缺失促进骨关节炎软骨细胞衰老

  2021-12-02    69  上传者:管理员

摘要:背景:骨关节炎以关节软骨的退变为主要病理特征,作为软骨中唯一的细胞,软骨细胞的衰老是骨关节炎发病的重要机制之一。但是骨关节炎的具体发病机制目前仍未清楚,因此探索疾病过程中的分子机制和信号通路变化,希望为骨关节炎的诊断与治疗提供新的生物靶点和研究方向。目的:探讨在骨关节炎进程中软骨PDZ结构域蛋白1(PDZDomainContaining1,PDZK1)对软骨细胞衰老的影响。方法:(1)8周龄C57/BL6小鼠随机分为实验组和假手术组,实验组又随机分为4,8周2个亚组。实验组小鼠行右侧膝关节内侧半月板胫骨韧带切除,游离内侧半月板,诱导骨关节炎;假手术组小鼠则仅切开关节囊而不行内侧韧带切除和半月板游离,检测PDZK1表达量。(2)用Ⅱ型胶原酶消化法分离新生C57/BL6乳鼠软骨细胞并培养,用10μg/L白细胞介素1β构建骨关节炎体外细胞模型,并利用siRNA-PDZK1敲低PDZK1,共分为未处理组、白细胞介素1β处理组(白细胞介素1β组)、siRNA-PDZK1组(si-PD组)、白细胞介素1β与siRNA-PDZK1共同刺激组(si-PD+白细胞介素1β组)。检测软骨细胞PDZK1表达量;检测软骨细胞形成指标(如Ⅱ型胶原a1)、分解代谢指标(如基质金属蛋白酶13)以及软骨细胞衰老指标(如P16、P21、P53)。结果与结论:(1)在C57/BL6骨关节炎小鼠膝关节软骨中,PDZK1表达较假手术组明显减少;(2)在C57/BL6乳鼠的原代软骨细胞中,通过免疫印迹实验证实,白细胞介素1β组与si-PD组的PDZK1表达量相比未处理组明显下降;si-PD组软骨细胞合成代谢指标Ⅱ型胶原a1表达量相比未处理组显著降低;si-PD+白细胞介素1β组分解代谢指标基质金属蛋白酶13表达量较白细胞介素1β组显著增加;(3)利用C57/BL6乳鼠的原代软骨细胞,通过实时荧光定量PCR证明,si-PD组敲低PDZK1后,细胞衰老指标P16、P21、P53表达较未处理组显著增加;(4)提示在骨关节炎进展中,软骨细胞中PDZK1的表达是降低的;PDZK1缺失可促进软骨细胞衰老,加重骨关节炎。所以PDZK1可能是骨关节炎发病过程中调节软骨细胞衰老的重要基因;对于PDZK1缺失促进软骨细胞衰老的机制,还需要更深入的研究。

  • 关键词:
  • PDZK1
  • 白细胞介素1β
  • 细胞衰老
  • 软骨细胞
  • 骨关节炎
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骨关节炎是一种退行性关节病变,最常受影响的关节是髋、膝、手、足和脊柱关节,而且是中老年人致残的主要原因[1]。在世界范围内,估计有2.5亿人患有膝关节骨关节炎,严重危害人类的身体健康。由于骨关节炎的发病机制目前还不清楚,临床上缺乏有效的可改善病情的药物,因而尚不能阻止疾病的进一步发展。因此,晚期骨关节炎患者,尤其是膝关节、髋关节骨关节炎患者只能选择行关节置换手术,从而给患者和社会带来沉重的负担[2,3]。所以阐明骨关节炎的发病机制,寻找有效的防治方案,对国内众多的骨关节炎患者具有重要意义。骨关节炎的致病因素复杂,目前认为衰老是骨关节炎最重要的危险因素之一[4]。

细胞衰老是指细胞在执行生命活动过程中,随着时间的推移,细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。电离辐射、氧化应激、端粒短缩、DNA损伤等均可启动细胞衰老程序,使软骨细胞活性氧含量增加、自噬受到抑制以及蛋白质折叠异常[5],并且分泌衰老相关分泌表型因子,如炎症因子(白细胞介素1α、白细胞介素6、白细胞介素8)、趋化因子、生长因子和基质金属蛋白酶等,使软骨细胞处于低水平慢性炎症状态[6]。相对于正常软骨,骨关节炎软骨细胞表现出诸多衰老相关指标,如端粒缩短、DNA损伤反应、活性氧分泌、β-半乳糖苷酶染色和调节细胞衰老的主要因子p16INK4a表达增加、基质金属蛋白酶聚集等[4]。细胞衰老的调控机制复杂,大量研究表明信号通路在调控细胞衰老中起重要作用。细胞衰老后,多种激酶和转录因子被激活,涉及多条细胞内信号转导通路,如p53、MAPK、Akt、核因子κB、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白及转化生长因子β等[7,8,9,10]。

PDZ结构域蛋白1(PDZDomainContaining1,PDZK1),又叫做NHERF3、PDZD1,主要分布于细胞膜上与细胞核内,属于钠(Na+)氢(H+)交换调节因子家族成员。PDZK1最初发现于肾脏近端小管的顶端刷状缘膜细胞内[11],该家族被证明在多种疾病和蛋白相互作用中发挥靶向和募集作用,为公认的衔接/支架蛋白家族[12,13],近年来PDZK1被证明在多种肿瘤中发挥调节作用。TAO等[14]证明PDZK1通过抑制SHP-1磷酸化,从而抑制肾细胞癌的进展。另外,YAN等[15]报道PDZK1甲基化水平与PI3K-Akt、p53信号通路相关,使卵巢癌细胞产生耐药性,从而使卵巢癌细胞增殖。此外,PDZK1还与炎症、线粒体功能以及尿酸代谢密切相关。LU等[16]利用人近曲小管上皮细胞HK-2发现白细胞介素1β可通过激活核因子κB,从而使PDZK1表达降低。FERNANDEZ-TORRES等[17]报道PDZK1是尿酸转运的关键分子,其与高尿酸血症有密切相关性,并且与骨关节炎的易感性有紧密联系。但PDZK1在软骨细胞中与细胞衰老的作用及其与骨关节炎的关系,未见相关报道。

此次实验拟探索骨关节炎进展中PDZK1蛋白在软骨中的表达情况以及PDZK1与软骨细胞衰老的关系,这将为骨关节炎的诊断和治疗靶点提供新思路与理论依据。


1、材料和方法


1.1 设计

随机对照动物实验,体外细胞干预实验,2组数据进行t检验,3组及以上数据进行One-wayANOVA检验。

1.2 时间与地点

实验于2019年7月至2020年8月在南方医科大学第三附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

8周龄雄性清洁级C57小鼠,共20只,体质量为25-28g,均由南方医科大学实验动物中心提供,合格证号:No.44007200038731。动物的饲养条件均按照清洁级实验动物管理标准,在恒定25℃、标准50%湿度,12h光照/黑暗循环的昼夜节律条件下,自由获取食物和水,每笼三四只小鼠,每隔5d更换一次垫料并添加适量的饲料和水,悉心照料。

1.3.2 小鼠原代软骨细胞来源

C57小鼠自我繁殖所得同窝6只出生3d内的C57BL/6乳鼠,雌雄不限。

1.3.3 实验使用的主要试剂和仪器

乙二胺四乙酸二钠、苏木精粉剂、番红O快速绿购自Sigma;甘油、多聚甲醛、体积分数75%乙醇及二甲苯购自广州化学试剂厂;抗体:PDZK1抗体(23274-1-AP)、Ⅱ型胶原抗体(15943-1-AP)、基质金属蛋白酶13抗体(18165-1-AP)购自Proteintech;兔抗羊、鼠抗羊二抗购自北京锐抗;荧光显微镜、倒置显微镜购自日本Olympus公司。重组鼠源性白细胞介素1β(R&DSystems美国);0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、青霉素-链霉素混合液;胎牛血清;反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(艾科瑞生物)。

1.4 方法

1.4.1 动物实验

(1) 实验动物分组及检测指标:将20只C57/BL6小鼠按随机数字表法分为实验组和假手术组,每组10只;实验组又随机分为4,8周2个亚组,各5只。在术后4,8周取材并进行番红O快速绿染色,通过免疫组织化学染色检测软骨细胞PDZK1的表达量。

(2) 小鼠骨关节炎模型建立:实验组小鼠行右侧膝关节内侧半月板胫骨韧带切除,游离内侧半月板。术前小鼠自由摄取食水,每周更换垫料,造模时间在小鼠10周龄、骨骼肌肉发育成熟后进行。麻醉前,利用天平称量每只小鼠的体质量,随后使用1%浓度的异氟烷行气体吸入维持麻醉,数分钟后观察小鼠肌张力,明确麻醉深度。麻醉起效后将小鼠右膝关节周围的鼠毛剔除,并用棉球蘸取碘伏进行消毒。随后在解剖显微镜下将小鼠右膝关节近内侧皮肤切开,沿髌骨韧带内侧纵行切开肌肉,将髌骨外翻后钝性分离肌肉与脂肪等组织,暴露胫骨平台与内侧半月板胫骨韧带。使用高压灭菌的显微剪将内侧半月板胫骨韧带切断,游离内侧半月板,造成膝关节不稳定以诱导骨关节炎[18],最后生理盐水冲洗,并将外翻的髌骨韧带复位,缝合关节囊与切口[19],并将小鼠放置于37℃恒温锅进行复苏。待麻醉苏醒后,将小鼠放回原笼中继续饲养,勤换垫料与观察伤口情况,小鼠自由摄取食水、可自由活动。假手术组仅切开关节囊。

(3) 关节标本的收集:在术后4,8周将小鼠过量麻醉致死。左手固定小鼠膝关节,利用手术刀切开小鼠右膝关节皮肤,钝性分离皮下组织,利用眼科剪剪断股四头肌肌腱,剪掉多余肌肉和软组织,于股骨中断离断股骨,下方剪断跟腱后于胫骨下端离断胫骨,保留完整的膝关节,为区分上下侧,习惯将股骨保留长度短于胫骨,再利用眼科剪将关节囊周围的肌肉软组织剔除干净,注意不要损伤到关节囊。置于上述配制好的多聚甲醛中,4℃冰箱恒温固定36h。

(4) 关节标本的处理:(1)脱钙:取固定完成后的膝关节,置于去离子水中冲洗1遍,去除多余多聚甲醛;然后更换成14%脱钙液,37℃摇床进行脱钙24d,每三四天换1次,直到针刺检测脱钙完成。(2)脱水:脱钙完成后的组织放于包埋盒中用去离子水冲洗12h;梯度乙醇脱水(体积分数依次为50%,70%,80%,95%,95%,100%,100%)60min。二甲苯Ⅰ60min;二甲苯Ⅱ60min;软蜡60min;硬蜡60min。(3)石蜡包埋:首先设置预定温度预热石蜡包埋机,使蜡池内蜡块充分溶解。脱水完成后,取出上述各标本,置于液体蜡池中,使用矢状面包埋(尽量保持膝关节内侧面平整贴于包埋盒底面)。待液体蜡覆盖后,将标本放置于低温冰台冷却凝固,蜡块凝固后,取下蜡块,置于-20℃冰箱冻存。(4)切片:切片厚度为10μm的情况下修整至可以看到内侧半月板开始分离,然后调整切片厚度为4μm,矢状面切片边切边展片观察,切片至看不到内侧半月板。(5)烘片:将上述切好的石蜡切片置于37℃恒温烤箱中烘烤24h,可以有效防止以后掉片,室温冷却后置于4℃冰箱保存,避免组织中的抗原失去活性,影响后续实验结果。

(5) 国际骨关节炎研究学会(OsteoarthritisResearchSocietyInternational,OARSI)评分:根据以往文献报道,利用番红O快速绿染色结果对小鼠骨关节炎严重程度进一步行评估[20]。至少请2位观察者进行双盲观察,在胫骨选取关节面中间进行观察。此次研究只进行关节面中间评分,评分细则大致为:正常(0分);少许番红O染色丢失,没有软骨结构改变(0.5分),没有软骨丢失的少量纤维化(1分);垂直裂缝至表层软骨一下,部分表层丢失(2分);垂直裂缝/侵蚀至钙化软骨层<25%的软骨面(3分);垂直裂缝/侵蚀至钙化软骨层25%-50%的软骨面(4分);垂直裂缝/侵蚀至钙化软骨层51%-75%的软骨面(5分);垂直裂缝/侵蚀至钙化软骨层>75%的软骨面(6分);共6分。

(6) 免疫组织化学染色:(1)取切好的标本,65℃恒温烤箱烤片60min。然后二甲苯脱蜡2遍后,再降梯度乙醇水化,具体过程为:二甲苯Ⅰ,10min;二甲苯Ⅱ,10min;无水乙醇Ⅰ,10min;无水乙醇Ⅱ,10min;体积分数90%乙醇,5min;体积分数80%乙醇,5min;体积分数70%乙醇,5min;体积分数50%乙醇,5min;最后用去离子水浸泡10min再进行免疫组化实验操作;(2)切片浸泡在枸橼酸纳溶液60℃水浴修复16-36h,使抗原充分暴露;(3)用PBS浸泡洗切片3次,5min/次;用免疫组化笔圈出样品,加入适量体积分数3%的过氧化氢溶液室温放置15min;(4)用PBS浸泡洗切片3次,5min/次;滴加体积分数10%山羊血清封闭液至标本完全覆盖,37℃烘箱封闭1h;(5)根据说明书配制PDZK1相应浓度的一抗工作液,4℃过夜放置16-36h;(6)切片从冰箱拿出复温至室温,用PBS浸泡洗切片3次,5min/次;现配现用,根据说明书配制一定浓度兔源性二抗工作液,室温条件反应1h;(7)用PBS浸泡洗切片3次,每次5min;接着进行DAB显色,待目标区域出现PDZK1的阳性颗粒后用去离子水浸洗干净;随后用苏木精复染细胞核20s,分化液浸泡1s,用去离子水将分化液浸洗干净,再将其浸泡在PBS中进行返蓝,在光学显微镜下观察,待细胞核颜色变为蓝色即可;(8)进行脱水透明:体积分数50%乙醇,2min;体积分数70%乙醇,2min;体积分数80%乙醇,2min;体积分数95%乙醇,2min;无水乙醇Ⅱ,1min;无水乙醇Ⅰ,1min;二甲苯Ⅰ,30s;二甲苯Ⅱ,30s。最后待切片风干后用中性树胶封固,若有气泡可轻微挤压,利用正置显微镜观察并进行统计PDZK1阳性细胞数。

1.4.2 细胞实验

(1) 小鼠原代软骨细胞提取:取出生3d内的C57/BL6乳鼠逐一称体质量,将1%戊巴比妥钠按照8μL/g的标准注入麻醉。断颈处死后放入体积分数75%的乙醇中消毒3-5min,将消毒后的乳鼠置于超净台中的无菌培养皿中,用已高压消毒过的眼科剪刀和眼科镊子分离出乳鼠的肋软骨。将带有软组织的肋软骨放置于无菌PBS中进行清洗,然后在大体解剖显微镜下将肋软骨进行粗分离,将明显的软组织剥离,尽量只留软骨部分。将其放置于0.25%的胰蛋白酶中37℃恒温消化30min,取出软骨,放置于新的无菌PBS中清洗,接着在大体解剖显微镜下将肋软骨进行细分离。将分离后的肋软骨放置在胶原酶培养基混合液(0.1%Ⅱ型胶原酶、体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM:F12培养基)中进行消化,用无菌封口膜密封离心管,放置于37℃恒温水平摇床消化5-8h,直到大部分肋软骨消化完成,将离心管放置在离心机上1000r/min离心10min,弃上清液,加入适量培养基(体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM:F12培养基)重悬软骨细胞,细胞悬液浓度为1×106,种植到6cm皿中,2只乳鼠的软骨细胞种一个皿,在37℃,体积分数5%的CO2条件下孵箱培养,每2d换液1次,长满后进行传代。原代软骨细胞需在3代以内使用。

(2) 细胞实验分组与检测指标:用白细胞介素1β(10μg/L)构建骨关节炎的体外细胞模型,并利用siRNA-PDZK1敲低PDZK1,共分为未处理组、白细胞介素1β处理组(白细胞介素1β组)、siRNA-PDZK1组(si-PD组)、白细胞介素1β与siRNA-PDZK1共同刺激组(si-PD+白细胞介素1β组)。检测软骨细胞的PDZK1、Ⅱ型胶原a1、基质金属蛋白酶13以及软骨细胞衰老指标(P16、P21、P53)的表达量。

(3) 白细胞介素1β刺激软骨细胞:将小鼠原代软骨细胞培养至第2代,待细胞浓度达60%-70%,进行白细胞介素1β刺激,以6孔板为例,每孔加入10μg/L,每孔细胞数约为2×106,制作骨关节炎体外模型[21]。

(4) 细胞转染实验:将小鼠原代软骨细胞培养至第2代,待细胞浓度达60%-70%,进行转染实验。以6孔板为例,先更换细胞培养液,接着配制转染复合物:4μL(20μmol/L)siRNA-PDZK1+4μL促转染试剂+200μL无血清培养基。静置30min后,将转染复合物缓慢滴入孔板中,轻轻震荡后,放入细胞培养箱,培养48h。siRNA-PDZK1:5’-GCAAUGGCUAUGGCUUCUATT-3’,5’-UAGAAGCCAUAGCCAUUGCTT-3’。

(5) 实时荧光定量PCR方法测定PDZK1、P16、P21、P53基因转录水平:取第2代原代软骨细胞,加入1mLTrizol裂解细胞,静置10min,加0.2mL的氯仿,充分混匀后静置5min再离心,取上层水相加入0.5mL的异丙醇,轻柔混匀后,离心弃去上清液,用体积分数75%的乙醇清洗离心后自然干燥沉淀RNA,加入DEPC水溶解RNA后,利用紫外分光光度计测量含量及纯度(纯度控制在1.8-2.0)。取TotalRNA1μg,加入gDNACleanReagent1μL和5XgDNACleanBuffer2μL及RNasefreeH2O,加至液体总量为10μL,先在42℃保温2min后,再依次加入EvoM-MLVRTaseEnzymeMix1μL,RTPrimerMix1μL5XRTaseReactionBufferMixI4μLRNasefreeH2O4μL。轻轻混匀后,先在37℃保温15min,然后85℃保温5s,得到cDNA20μL,选择20μL的反应体系,分别应用GAPDH、PDZK1、P16、P21以及P53的上、下游引物见表1,对反转录的cDNA进行RealTimePCR反应。反应体系为上、下游引物(10mol/L)各0.4μL,模板cDNA2μL,ddH2O7.2μL,SYBRGreen10μL。采用两步法进行PCR反应,反应条件:95℃、10min,1个循环;95℃、15s;60℃、1min,40个循环。反应结束后,采用ABI7300RealtimePCR软件分析PCR过程,检测样本的Ct值,即PCR扩增过程中扩增产物荧光信号超过基线值(进入指数增长期)时的循环数。以GAPDH为内参照基因,通过2-ΔΔCt法进行相对定量分析。细胞实验结果重复3次。

(6) 免疫印迹(WesternBlot)

干净的玻璃板准备:使用之前,首先利用体积分数75%乙醇或者去离子水清洗大小2块玻璃板,用吸水滤纸或者干净的眼镜布把液体擦拭干净,然后利用37℃的烘箱进行烘干。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配置:按照厂家说明书的配方,根据所需要胶的数量配制好相应分离胶液体并混匀,将已经混匀的分离胶溶液缓慢加入玻璃板夹层中,尽量不产生气泡,当分离胶的液体顶端距玻璃板上端1.5-2.5cm时,此时停止添加,并同时加入去离子水覆盖分离胶的顶端,把潜在的气泡去除,将其放在室温中,待分离胶凝固,即去离子水与分离胶之间有一个清晰笔直的边界。然后根据配方和需要的胶数量配制浓缩胶,倾斜玻璃板,倒掉ddH2O,把剩余的ddH2O使用吸水滤纸吸干。将以上配好的浓缩胶液体小心翼翼打入分离胶上,充分覆盖分离胶,把液体加满,将明显的气泡挤出,然后快速轻柔插入用ddH2O洗干净,用吸水滤纸吸干梳子,室温放置40min左右,等上层浓缩胶凝固后,可以肉眼看到梳子与胶的明显分界。若不马上上样可将配好的胶用去离子水浸湿后包上保鲜膜放于4℃冰箱。

蛋白上样及电泳:从-80℃冰箱中取出提取的样品,使用100℃金属浴加热5min,随后快速离心2min,离心后的样品在加样前先用移液枪充分吹打混匀,根据BCA测得的各个样品浓度,定量上样入上述胶的对应孔中(首次均加入10μL),以恒定电流16mA/胶的条件电泳90-120min,根据所需目的蛋白的大小,控制好电泳时间,保证蛋白不要跑出泳道。期间使用去离子水和甲醇溶液稀释配置1X的转移液,切记要将其放入-20℃冰箱进行预冷。

转膜:将上述电泳完成的胶上的蛋白质转移至PVDF膜上,转膜过程中注意避免产生气泡,造成实验结果条带不清晰,而且夹板的黑色面对着胶,夹板的白色面对着膜,做到胶膜夹的充分贴合。以恒定电压150-220V的条件转膜90-120min,转膜电压和转膜时间要根据目的蛋白大小来调整。

封闭:将转膜完成的PVDF膜放置于封闭液(5%牛奶)中,室温条件下慢摇床封闭1h,减少抗体的非特异性结合。

孵育一抗:封闭结束后,用1X的TBST涮洗PVDF膜数秒,按照Ⅱ型胶原a1、基质金属蛋白酶13蛋白分子量裁剪条带,并对应加入配制好的Ⅱ型胶原a1、基质金属蛋白酶13一抗抗体稀释液,稀释比例参考抗体的说明书,在4℃条件下慢摇摇床孵育16-24h,使抗体与目的蛋白充分结合。

孵育二抗:回收一抗,用1X的TBST清洗液,室温下在快摇摇床上进行3次洗膜,5min/次。根据二抗说明书配制相应浓度的二抗抗体稀释液,切记二抗抗体稀释液要现配现用,二抗孵育在室温下慢摇床孵育1h。

软件曝光:用1X的TBST清洗液,室温下在快摇摇床上进行5次洗膜,3min/次。一般1个条带需要100-200μL曝光液,取等体积的显示A和显示B工作液,在避光1.5mLEP管中混匀,配制适量的ECL工作液。软件设置条件下按时间梯度进行曝光。

分析结果:根据内参分析条带的灰度值,来调整下一次上样量。

1.5 主要观察指标

(1)建立小鼠骨关节炎模型,分别在实验4,8周取材,首先通过番红O快速绿染色对小鼠进行OARSI评分;接着利用PDZK1免疫组化染色确定骨关节炎中的表达情况;(2)分离培养C57/BL6乳鼠原代软骨细胞,利用白细胞介素1β与siRNA-PDZK1处理后,通过免疫印迹实验检测PDZK1表达情况以及软骨细胞代谢改变。

1.6 统计学分析

统计学处理均由第一作者进行。采用MicrosoftExcel工作表整理汇总实验结果和资料,AdobePhotoshop2020软件处理图片,GraphPadPrism8.0.1软件制作统计图,SPSS20.0软件对数据进行统计分析。对2组数据进行t检验,对3组及以上数据进行One-wayANOVA检验,P<0.05为差异有显著性意义。


2、结果


2.1 实验动物数量分析

所有小鼠均无脱失,全部进入结果分析。

2.2 PDZK1在骨关节炎关节软骨中的表达情况

为了检测PDZK1在骨关节炎动物模型中的表达情况,对小鼠的关节软骨进行了相关检测。在此次研究中,对内侧半月板不稳定-骨关节炎小鼠模型术后4,8周进行取材。首先,对实验组小鼠术后4周进行取材并染色,关节面出现部分的蛋白聚糖的丢失以及轻微软骨退变;实验组小鼠术后8周取材并染色,可见软骨退变程度加重,出现软骨皲裂、剥脱、丢失,软骨下骨硬化明显,骨赘形成;假手术组关节面完整、无蛋白聚糖丢失。与假手术组相比,实验组小鼠术后4周OARSI病理评分显著升高,差异有显著性意义(P<0.01)。而且实验组小鼠术后8周OARSI病理评分也显著高于假手术组,差异有显著性意义(P<0.01)。即证明造模是成功的,见图1。

实验组OARSI病理评分标准主要参考Glasson评分细则(标准详见方法部分),接着通过免疫组织化学染色对小鼠的关节软骨的PDZK1表达情况进行检测。结果发现,与假手术组相比,术后4周实验组小鼠关节软骨细胞的PDZK1表达量明显降低(P<0.01);另外,术后8周实验组小鼠关节软骨细胞的PDZK1表达量也显著低于假手术组(P<0.01)。通过对结果进行计数分析其阳性率,统计学分析差异有显著性意义,见图1。

2.3 敲低PDZK1后软骨细胞合成代谢减弱,分解代谢增强

分离培养小鼠原代软骨细胞,为在体外骨关节炎模型中查看PDZK1的表达量改变以及验证siRNA-PDZK1的敲低效果,分别利用siRNA-PDZK1与白细胞介素1β刺激软骨细胞48h,用WesternBlot方法检测PDZK1的表达量。作者发现,白细胞介素1β组、si-PD组以及si-PD+白细胞介素1β组软骨细胞的PDZK1表达量均显著低于未处理组,见图2。即体外骨关节炎模型中PDZK1的表达量也是降低的,与动物体内实验结果相符合;而且siRNA-PDZK1有明显敲低效果。

为探究PDZK1与软骨细胞代谢的关系,利用siRNA-PDZK1与白细胞介素1β刺激软骨细胞48h,建立骨关节炎体外模型,用WesternBlot方法检测Ⅱ型胶原a1与基质金属蛋白酶13的表达量。作者发现,si-PD组敲低PDZK1后,与未处理组相比,软骨细胞Ⅱ型胶原a1表达显著减少,即敲低PDZK1后,软骨细胞合成代谢减弱;同时,与白细胞介素1β组相比,si-PD+白细胞介素1β组的基质金属蛋白酶13表达显著增加,即在骨关节炎体外模型中,敲低PDZK1后,软骨细胞分解代谢显著增强,见图3。

2.4 敲低PDZK1后可使软骨细胞高表达衰老指标

siRNA-PDZK1处理软骨细胞后,软骨细胞衰老指标表达量增加。利用siRNA-PDZK1刺激软骨细胞48h,通过对软骨细胞衰老指标P16、P21、P53基因表达的相对定量检测,进一步研究PDZK1对软骨细胞衰老的影响,见图4。与对照组相比,siRNA-PDZK1组PDZK1基因相对表达水平明显降低,差异有显著性意义(P<0.01);与此同时,软骨细胞衰老指标,包括P16、P21、P53,基因相对表达水平均显著升高,差异有显著性意义(P<0.01)。


3、讨论


关节软骨退行性变是骨关节炎最具特征性的病理改变,而软骨细胞是成熟关节软骨的唯一细胞类型,其功能紊乱被认为是骨关节炎发病的关键因素。当软骨发生退变时,软骨细胞合成分解代谢被破坏,最终引起软骨不可逆的损伤[22,23],恢复软骨细胞正常功能是骨关节炎治疗的主要目标之一。骨关节炎有诸多危险因素,包括关节创伤、肥胖、性别等[24,25,26],但是衰老是最突出的危险因素[27],近年来软骨细胞衰老在骨关节炎中的作用逐渐受到重视。KANG等[28]证明由应力激活的miR-204可促进软骨细胞衰老,从而加重骨关节炎。GAO等[29]发现软骨衰老细胞数量与骨关节炎病变程度呈正相关,衰老的软骨细胞主要集中在软骨磨损处。MATSUZAKI等[30]发现衰老小鼠中SIRT1表达降低,而且在机械应力刺激下其表达先增加后降低,进而加重骨关节炎。另外,KIM等[31]阐明机械应力与衰老通过不同的分子机制导致细胞外基质结构重塑,从而影响骨关节炎进展。小鼠关节腔内注射衰老细胞可诱导关节软骨破坏,特异性敲低软骨细胞p16INK4a的表达,能抑制软骨细胞衰老并延缓骨关节炎的病变程度[32]。然而,软骨细胞衰老从而导致骨关节炎的具体分子机制尚不清楚,而且PDZK1与细胞衰老的关系以及PDZK1与骨关节炎的机制研究也未见报道。

此次研究通过体内与体外实验阐述了在骨关节炎中PDZK1与软骨细胞衰老的关系。首先,利用成年的C57/BL6小鼠进行骨关节炎模型制作,分别在造模4,8周取材,通过番红O染色及OARSI评分验证造模效果,造模4周组小鼠表面关节软骨出现蛋白聚糖的丢失;造模8周组小鼠表面关节软骨出现明显破裂缺损;两组OOAARRSSII评分较假手术组均明显升高;紧接着,通过PPDDZZKK11的免疫组化染色发现,造模小鼠表面软骨层PDZK1阳性细胞数较假手术组明显降低。另外通过C57/BL6新生乳鼠的肋软骨提取原代软骨细胞,进行白细胞介素1β刺激以及转染siRNA-PDZK1,利用Westernblot技术,发现与未处理组相比,白细胞介素1β刺激后软骨细胞PDZK1表达明显降低,这与动物实验结果相契合;转染siRNA-PDZK1后,软骨细胞PDZK1表达显著降低,验证了siRNA-PDZK1的敲低效果。

同时还发现,敲低PDZK1后,软骨细胞Ⅱ型胶原表达量较未处理组明显降低,即敲低PDZK1后可能会促进软骨细胞的分解代谢;而且白细胞介素1β与siRNA-PDZK1共同刺激组的软骨细胞表达基质金属蛋白酶13明显高于白细胞介素1β刺激组,即在体外骨关节炎模型中,敲低PDZK1可抑制软骨细胞的合成代谢。另外转染siRNA-PDZK1后,提取原代软骨细胞的RNA,利用荧光定量PCR分析发现,与未处理组相比,敲低PDZK1后促进细胞衰老相关基因表达,包括P16、P21以及P53;即敲低PDZK1后,可能会促进软骨细胞衰老。目前,关于细胞衰老与骨关节炎的研究日益全面,在细胞衰老通路的上游信号调控网络中,miRNA和转录因子发挥着重要作用,主要作用于p53/p21、p16/Rb衰老细胞轴或衰老相关分泌表型的产生[33]。此外,随着骨关节炎基础研究的逐步深入,揭示环状RNA在骨关节炎症调控、软骨细胞的衰老凋亡、细胞外基质成分改变以及机械应力刺激等多种病理机制中起重要作用。而此次研究只是初步证明在骨关节炎中PDZK1与细胞衰老的相关性,仍需进一步探究在骨关节炎中PDZK1调节细胞衰老的具体机制以及其上下游调控因素。

因此作者认为,在骨关节炎中PDZK1的缺失可促进软骨细胞衰老;PDZK1可能是在骨关节炎发病过程中调节软骨细胞衰老的重要基因,可能是软骨细胞衰老调节的新靶点。对于PDZK1的缺失促进软骨细胞衰老的具体分子机制,还需要更深入的研究。

此次研究尚存一些不足之处:(1)选取Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13作为软骨细胞的合成与分解代谢评估指标,未能全面评估软骨细胞的合成与分解代谢的具体情况,需增加软骨细胞的合成与分解代谢指标,做进一步研究;(2)只在C57/BL6成年骨关节炎小鼠身上发现PDZK1表达差异,若有条件,应在骨关节炎患者软骨标本上探索PDZK1的表达情况,这样才更贴近临床;(3)未探索PDZK1对骨关节炎的直接作用,以及未涉及PDZK1对软骨细胞衰老以及骨关节炎相关信号通路的调控;(4)仅通过体外敲低PDZK1后分析软骨代谢的变化,未通过体内抑制PDZK1实验来探究PDZK1对软骨细胞代谢的影响。

综上所述,在骨关节炎发病进程中,PDZK1的表达在软骨中存在差异性,随着骨关节炎的进展PDZK1表达明显降低;另外敲低PDZK1后,可促进软骨细胞表达衰老相关蛋白。因此,PDZK1是骨关节炎病变过程中调控软骨细胞衰老的重要基因,可为骨关节炎的机制研究提供新的研究方向。


参考文献:

[33]谢锦伟,鲁凌云,余希杰.细胞衰老在骨关节炎发病机制中的研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2021,35(4):519-526.


文章来源:关鸿,张宏博,邵焱,郭栋,张海严,蔡道章.PDZ结构域蛋白1缺失促进骨关节炎软骨细胞衰老[J].中国组织工程研究,2022,26(02):182-189.

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