文题释义：

等离子喷涂：是一种材料表面强化和表面改性的技术，可使基体表面具有耐磨、耐蚀等性能，采用等离子电弧作为热源，将无机盐等材料加热到熔融或半熔融状态，并以高速喷向经过预处理的工件表面而形成附着牢固表面层的方法，在组织工程的涂层制备中被广泛使用。

电化学沉积：是指金属或合金在无机盐、生物活性因子等水溶液、非水溶液中表面形成涂层的过程，是目前较有前景的组织工程涂层制备工艺之一。该技术沉积的难易程度以及沉积物的形态与沉积物的性质有关，也依赖于电解质的组成、pH值、温度、电流密度等因素。

引言Introduction

近年来在骨科植入物方面，增材制造(3D打印)制备的植入物实现了与体内骨缺损外形的良好匹配，且其具备的孔隙结构不仅减轻了应力遮挡[1]，并且加速了新骨的长入[2]，因而在骨移植、骨融合等骨修复手术中被广泛使用[3]。3D打印数字化和快速成型的特点，使其能根据患者的解剖学特点定制个体化植入物，达到相对精确匹配，在医学领域有着广阔的应用前景[4,5]。钛及其合金因优异的生物相容性、稳定的力学特性成为3D打印支架的首选材料，然而，钛的表面惰性一定程度上导致了其与周围骨组织的骨整合不良[6]，常需要对其表面进行改性以增加生物活性。由于羟基磷灰石拥有良好的骨诱导能力，在生理环境下性能稳定，可以为骨细胞的黏附、生长提供良好的支撑，并为骨细胞钙化成骨提供晶核，发挥骨传导作用[7,8]，常被用于制作3D打印钛支架的生物涂层。

课题组在电化学沉积羟基磷灰石涂层过程中发现，随沉积时间的延长，羟基磷灰石涂层发生的形貌改变对成骨细胞增殖分化具有很大影响[9]，这提示羟基磷灰石涂层的形貌改变会对细胞的活动造成不同影响。因此，3D打印钛支架上不同技术制备的羟基磷灰石涂层形貌对于细胞生物学的影响引起了作者的重视。

等离子喷涂羟基磷灰石是在真空中使用高速气流将融化的羟基磷灰石颗粒喷射至钛或其他金属基质表面，形成较为牢固的涂层[10]。等离子喷涂属于视线喷涂技术，需要操作视野良好，较难控制涂层结构，且涂层较难覆盖复杂的材料孔隙内部[11,12]。目前已有水蒸气法处理改善等离子喷涂羟基磷灰石涂层，制备出均匀的羟基磷灰石涂层[13]。电化学沉积是目前被认为较有发展前途的新工艺之一，在室温下即可制备羟基磷灰石涂层，无需大型仪器设备[14]，可在各种复杂结构的材料上进行沉积，改变沉积条件(如电流等)便可改变并控制涂层的结构[15]。但有研究认为电化学沉积羟基磷灰石涂层与材料的黏附度不高[16]。目前在对生物支架及涂层的研究中，大多数针对于成骨细胞在骨修复过程中的影响及机制，如3D打印钛/羟基磷灰石支架电化学时间对MC3T3-E1细胞的影响[9]。而在骨修复过程中，骨髓间充质干细胞作为存在于骨髓组织中的一类成体干细胞，在一定诱导条件下具有向成骨细胞、脂肪细胞及骨骼肌、造血支持基质等中胚层细胞分化的能力，该细胞跨系甚至跨胚层横向分化的可塑性及强大的分化潜能可为组织修复提供可能性[17]。因此，不同工艺制备的羟基磷灰石涂层形貌对骨髓间充质干细胞行为学的影响引起了作者的重视，然而有关等离子喷涂与电化学沉积羟基磷灰石涂层形貌对骨髓间充质干细胞增殖、黏附及成骨分化影响的对比研究目前在国内外鲜有报道。

1、材料和方法Materialsandmethods

1.1设计

体外细胞学观察实验。

1.2时间及地点

实验于2019年7月至2020年8月在徐州医科大学公共实验平台完成。

1.3材料

3D打印钛支架及电化学沉积羟基磷灰石涂层由北京纳通公司制备；等离子喷涂羟基磷灰石涂层由中国科学院上海硅酸盐研究所制备；SD大鼠骨髓间充质干细胞由中国科学院细胞库提供；α-MEM培养基、0.25%胰蛋白酶-ED-TA(Gibco,USA)；胎牛血清(Clark,USA);PBS、青霉素/链霉素双抗(Hyclone,USA);CCK-8试剂盒(同仁，Japan)；骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基、茜素红染液(赛业生物，中国)；碱性磷酸酶染色试剂盒、DAPI染液(索莱宝，中国)；鬼笔环肽-iFluor488(西安百莹，中国)；40g/L多聚甲醛(Vicmed，中国)。

1.4实验方法

1.4.1钛/羟基磷灰石支架的制备及表征

按课题组前期研究结果制备底面直径6mm、高5mm、孔径350μm、孔隙率为48%的圆柱体钛支架[9]。(1)电化学沉积羟基磷灰石涂层：将磷酸二氢钠溶液和硝酸钙溶液混合，磁力棒搅拌混匀，将部分钛支架清洗后置于混合溶液中，采用电化学工作站于室温下进行电化学沉积，沉积后样品经过纯化水清洗并吹干备用；(2)等离子喷涂羟基磷灰石涂层：采用等离子电弧作为热源，将羟基磷灰石粉末加热到熔融状态，于真空中高速喷向钛支架表面，形成牢固涂层。无涂层钛支架作对照组。通过扫描电镜观察支架表面羟基磷灰石涂层的形貌并测量孔径。

1.4.2培养基的配置

基础培养基：α-MEM培养基补充加入体积分数10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素，摇匀混合后备用。成骨诱导培养基：在基础培养基的基础上加入100mmol/L地塞米松、10mmol/L甘油磷酸钠和50µmol/L的L-抗坏血酸。

1.4.3骨髓间充质干细胞的培养与传代

待细胞生长至铺满培养瓶或皿底部80%-90%时即可进行传代。注意细胞密度不能过高。弃掉上清细胞培养液，PBS轻柔漂洗2次，加入适量(以刚好完全覆盖所有细胞为准)0.25%胰酶于培养箱中孵育3-5min，以使细胞消化。待细胞间隙完全打开、部分细胞漂浮或变为圆形后终止消化。将相应的细胞悬液移到15mL离心管中，常温800r/min离心3min，弃上清液，2.0-3.0mL生长培养基重悬细胞。取10μL细胞悬液，适当稀释后细胞计数板镜下计数，计算细胞密度。以4×104/cm2的细胞密度种板培养。接种后的细胞仍放置于体积分数5%CO2、37℃、相对湿度90%的细胞培养箱内培养。

1.4.4骨髓间充质干细胞的鉴定

将5×104/孔的第3代骨髓间充质干细胞悬浮液加入6孔板中，使用基础培养基培养，每3d进行换液，待细胞融合度达到80%时弃掉上清液，PBS轻柔漂洗2次，加入成骨诱导培养基，每孔2mL，每3d换液一次，诱导2-4周后视细胞的形态变化及生长状态进行茜素红染色，注意当2周后孔板内开始出现钙结节，换液形式改为每2d一次半换液。同时设置副孔，使用基础培养基培养骨髓间充质干细胞相同天数后进行茜素红染色。

1.4.5骨髓间充质干细胞增殖检测

首先使用高温高压蒸汽灭菌法对3组支架进行消毒灭菌处理，使用无菌镊子转入24孔板中，加入2mL基础培养基反复吹打支架，润湿后将支架转入96孔板，将1×104/孔的骨髓间充质干细胞悬浮液与支架共培养。培养1,3,5,7d后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，避光孵育1-4h，待孔内溶液变成橘黄色后使用酶标仪测量450nm处的吸光度A值，定义1d时细胞增殖率为1.0,3,5,7d的细胞相对增殖率计算如下：

细胞增殖率=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%,As为实验孔，Ac为对照孔，Ab为空白孔；

细胞相对增殖率=第n天增殖率/第1天增殖率。

1.4.6骨髓间充质干细胞的黏附、形态检测

将骨髓间充质干细胞以3×104/孔的密度接种在3组支架上，使用基础培养基在24孔板中孵育。5d后，用PBS洗涤在支架上培养的细胞3次，用电镜固定液避光固定过夜，使用乙醇(体积分数25%,50%,75%和100%)梯度脱水，在室温下干燥过夜，喷金后扫描电镜下观察。将细胞-支架在40g/L多聚甲醛中浸泡30min以固定骨髓间充质干细胞，接着加入鬼笔环肽-iFluor488染色45min，标记出细胞的肌动蛋白，使用PBS洗涤2次，加入DAPI染液，10min后使用PBS洗涤去掉多余染液，标记出细胞核。使用激光共聚焦显微镜观察与支架共培养的骨髓间充质干细胞黏附、形态。

1.4.7骨髓间充质干细胞的成骨分化检测

将骨髓间充质干细胞以2×104/孔的细胞密度与3组支架共培养。

碱性磷酸酶染色：共培养第14天进行碱性磷酸酶染色。PBS洗涤细胞3次，40g/L多聚甲醛固定30min；再次PBS洗涤后加入碱性磷酸酶孵育液，37℃孵育15min；使用PBS洗涤去掉多余孵育液，加入Co溶液，37℃孵育5min;PBS洗涤后加入硫化工作液，孵育2min后去掉多余染液，倒置光学显微镜下观察并拍照。

茜素红染色：共培养第21天进行茜素红染色，矿化结节被染为红棕色。PBS洗涤细胞3次，40g/L多聚甲醛固定30min，加入茜素红染液室温下染色10min,PBS洗涤2遍去除多余染液，光学显微镜下观察并拍照。

qRT-PCR检测：共培养7,14d后，测定Ⅰ型胶原蛋白、Runx2、骨钙蛋白及骨桥蛋白的mRNA表达水平。首先加入1mL的TRIeasy试剂，反复吹打支架，避免产生气泡，室温下静置2min以充分裂解支架上的细胞。在1mLTRIeasy中加入0.2mL氯仿，摇晃EP管30s，室温静置3min。4℃下12000r/min离心15min后可见液体分为3层，底部的苯酚-氯仿层、中间层和无色水样上层，RNA在上层水样中，体积占总体积50%左右。吸取上层水样至新EP管中，避免吸到中下层液体。加入0.5mL异丙醇，上下颠倒混匀，4℃下1000r/min离心15min，充分沉淀RNA，可在管底见白色沉淀。弃去上清只留沉淀，加入1mL体积分数75%乙醇，震荡洗涤后4℃下7500r/min离心5min，弃去上清，室温下干燥10min，加入20μL无核酶水溶解RNA，利用NanoDrop2000c测量提取的RNA浓度。使用VazymeRT试剂盒将获得的RNA反转录为单链cDNA，使用带有96孔板的LightCycler480II仪器进行实时PCR分析。引物序列见表1。将目标基因的表达水平相对于GAPDH进行标准化，并利用2-∆∆Ct方法计算每个目标基因的相对基因表达值。以上实验重复3次，取平均值。

表1|qRT-PCR检测所用引物序列

1.5主要观察指标

钛支架上羟基磷灰石涂层形貌及涂层对支架孔径、孔隙率的影响；各组钛支架上骨髓间充质干细胞的增殖、黏附及成骨分化。

1.6统计学分析

应用SPSS22.0统计软件进行统计分析，所有数值数据均用表示。组间比较进行单因素方差分析，若P<0.05表示差异有显著性意义。

2、结果Results

2.1羟基磷灰石涂层钛支架的表征

如图1所示，两种涂层的表面形貌差异很大，电化学沉积组涂层可见由羟基磷灰石针状结构聚集并组合成片状、板状结构，表面仍可见小部分未被涂层覆盖的钛颗粒，涂层较为粗糙；等离子喷涂组涂层表面与其截然不同，熔融的羟基磷灰石均匀地喷涂在支架表面，涂层较为平整，表面可见细小的颗粒状、球状羟基磷灰石堆积，但涂层中可见细小裂纹。

等离子喷涂组、电化学沉积组及对照组支架的孔径分别为(351.71±4.97),(351.76±3.69),(352.26±3.97)μm，各组间不存在差异(F=0.169,P=0.848)，说明涂层的制备并没有改变支架的孔径。

2.2骨髓间充质干细胞的鉴定

如图2所示，将第3代骨髓间充质干细胞采用成骨诱导培养基培养21d后，细胞呈复层样生长，十分密集，细胞已逐渐从骨髓间充质干细胞的梭形变为多边形，形成地板装样形态，茜素红染色可见6孔板底出现大面积红色钙结节，部分钙结节中心为红棕色；对照组骨髓间充质干细胞使用基础培养基培养21d后，茜素红染色并无红色钙结节，细胞形态依旧为梭形。

2.3骨髓间充质干细胞与支架共培养后的增殖

如表2所示，随着培养时间的延长，3组细胞增殖A值增加，等离子喷涂组、电化学沉积组培养各时间点的A值高于对照组(P<0.05)，并且等离子喷涂组培养各时间点的A值高于电化学沉积组(P<0.05)。

2.4骨髓间充质干细胞与支架共培养后的黏附及形态

共培养5d后的扫描电镜显示，3组支架上均可见骨髓间充质干细胞黏附，其中等离子喷涂组细胞铺展面积最大，细胞出现多个丝状伪足向周围延伸且伸展充分；电化学沉积组的细胞多黏附在片状、针棒状羟基磷灰石涂层上，细胞丝状伪足伸出较少且延展不充分；对照组支架上的细胞形态多是黏附并包裹钛颗粒，细胞铺展面积最小，仅有少部分细胞出现明显丝状伪足，见图3。

表2|各组钛支架上骨髓间充质干细胞的相对增殖率

激光共聚焦显微镜下可见，等离子喷涂组骨髓间充质干细胞肌动蛋白纤维最为致密，细胞更为细长，细胞伸展状态良好，拥有紧密的丝状延展；电化学沉积组的细胞肌动蛋白相对致密，少部分细胞呈细长状，细胞伸展状态一般；对照组支架上的骨髓间充质干细胞肌动蛋白相对稀疏，细胞多呈多边形，细胞伸展不充分，以板状伪足为主，见图4。

2.5骨髓间充质干细胞与支架共培养后的成骨分化

培养第14天的碱性磷酸酶染色显示，等离子喷涂组细胞中显现大面积黑色氧化钴，显示出高碱性磷酸酶活性；电化学沉积组中黑色氧化钴面积偏少，与对照组几乎无黑色氧化钴相比碱性磷酸酶活性有所增强，但逊于等离子喷涂组，见图5。

共培养21d后的茜素红染色显示，等离子喷涂组的矿化结节呈密集趋势，已开始聚集出现团块状结节，结节颜色呈红色，中心区域已呈红褐色；电化学沉积组中的矿化结节较小，较分散，颜色相对偏浅；对照组中出现少部分浅红色、点状、分散稀疏的小结节，见图6。

为方便统一计算、统计分析，将对照组中数据进行标准化处理为1。相同时间点下，等离子喷涂组、电化学沉积组的骨桥蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、Runx2mRNA表达均高于对照组(P<0.05)。除7d的骨钙蛋白mRNA与14d的Runx2mRNA表达无差异外，等离子喷涂组相同时间下的骨桥蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、Runx2mRNA表达均高于电化学沉积组(P<0.05)，见表3。

2.6材料生物相容性

由实验增殖与黏附检测结果可知，等离子喷涂与电化学沉积羟基磷灰石涂层具有良好的生物相容性。

表3|各组钛支架上骨髓间充质干细胞的成骨基因表达

图1|等离子喷涂与电化学沉积羟基磷灰石涂层的形貌

图2|骨髓间充质干细胞的鉴定

图3|骨髓间充质干细胞在3种钛支架上培养5d的黏附

图4|骨髓间充质干细胞在3种钛支架培养5d的黏附

图5|各组钛支架诱导骨髓间充质干细胞的早期成骨分化

图6|骨髓间充质干细胞与3组钛支架共培养21d后的矿化结节

3、讨论Discussion

在组织工程中羟基磷灰石涂层的加入增加了钛支架表面的生物活性能，不仅能为骨细胞的黏附、生长提供良好的支撑，还可提高钛支架表面的润湿性与骨传导性，而这对细胞的黏附、增殖、分化及骨界面的早期愈合均有积极作用[18]。但羟基磷灰石粒径过大会增加种植体表面积，造成离子过多泄露，并难以降解[19]；相反，如果羟基磷灰石粒径过小会在吞噬作用后引起细胞毒性[20]，同时羟基磷灰石涂层形貌对重塑骨组织起至关重要的作用[21]，这提示不同工艺制备的羟基磷灰石形貌对骨髓间充质干细胞的增殖、分化有不同的影响作用。

KUBOKI等[22]发现支架300-400μm孔径最适宜骨长入。在小孔径支架中会先形成软骨，再进一步矿化，而在大孔径支架中更倾向于直接形成骨组织[23]，因此该实验选用350μm孔径的钛支架。采用电化学沉积与等离子喷涂技术于3D打印钛支架表面制备羟基磷灰石涂层，两种涂层的形貌截然不同，电化学沉积组涂层可见羟基磷灰石颗粒聚集形成针、棒样结构并逐渐融合形成片、板状结构，部分钛颗粒表面没有完全被羟基磷灰石涂层覆盖，涂层较薄，与其他技术相比，采用电化学沉积技术形成的结晶涂层是多孔且更为凹凸不平；而等离子喷涂组涂层成表面较为平整、连续，几乎不可见钛颗粒结构，可见细小颗粒状、球状羟基磷灰石，较电化学沉积组涂层厚度厚。同时两种涂层均没有改变支架的孔径，各组的孔径与设计误差均小于±10μm。由于3D打印钛支架不同的孔径参数对细胞的增殖、分化起不同影响，因此在涂层的制备上要注意不应改变支架原有的微孔参数而影响支架内营养物质的交换，以免对骨整合造成不良影响。

钛支架的羟基磷灰石涂层对细胞黏附起到了重要作用。实验在等离子喷涂、电化学沉积羟基磷灰石涂层上培养骨髓间充质干细胞，并使用扫描电镜、共聚焦荧光显微镜观察细胞黏附、形态情况，发现等离子喷涂组的细胞伸展良好，伸出较多伪足，且以丝状伪足为主，细胞更为细长；电化学沉积组的细胞以伸出板状伪足为主，伸展欠佳，说明等离子喷涂组的细胞黏附、形态较电化学沉积组更好。HULBERT等[24]发现随羟基磷灰石涂层粗糙度的增加，细胞附着率也随之提高。对比无涂层钛支架上的细胞形态，虽然电化学沉积组的细胞形态更为优异，但电化学沉积形成的较粗糙片状堆叠结构对细胞形态影响并没有等离子喷涂涂层优秀，同时等离子喷涂涂层表面存在密集的微小羟基磷灰石颗粒，涂层并不光滑，因此作者认为涂层的完整性、连续性是影响骨髓间充质干细胞黏附、伸展的重要因素。

既往研究认为支架表面越粗糙更利于细胞的增殖，一方面是由于此结构有更多的表面积提供细胞黏附增殖，另一方面羟基磷灰石具有润湿性，使得支架的润湿性增加，为支架内的细胞提供更好的营养物质[25]。但此次实验CCK-8检测发现，等离子喷涂组3,5,7d的细胞增殖均多于电化学沉积组。电化学沉积组涂层表面依然可见部分裸露的钛颗粒，所以羟基磷灰石涂层较等离子喷涂组更薄一些，而羟基磷灰石可以促进骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化[26,27]，因而等离子喷涂组较厚的涂层可以更好地促进骨髓间充质干细胞的增殖。ROYCROFT等[28,29,30]研究发现细胞在体外培养到一定程度，当密度过大后细胞膜表面的糖蛋白便会识别这种信息，使细胞停止增殖生长。虽然电化学沉积组涂层形貌较为粗糙，但垂直的片状羟基磷灰石涂层及其间隙反而可能导致供细胞生长表面积降低，影响细胞的生长及增殖。PAPAGEORGIOU等[31]研究表明，材料应首先使干细胞富集，增加数量，然后再诱导其向成骨分化，促进骨缺损修复。等离子喷涂组更平整且连续的涂层形貌为骨髓间充质干细胞的生长提供了更好的环境，平整的形貌使细胞可以直接接触营养物质及氧气，这直接促进了细胞的增殖，且微小的羟基磷灰石颗粒并没有造成细胞毒性[32,33]。

碱性磷酸酶是反映骨髓间充质干细胞早期成骨分化的重要指标之一。此次实验在骨髓间充质干细胞与支架共培养14d后，采用钙钴法对细胞进行染色，碱性磷酸酶增强的区域被染为黑色，结果发现等离子喷涂组的黑色区域明显多于电化学沉积组，这证明等离子喷涂羟基磷灰石涂层对骨髓间充质干细胞早期成骨分化起积极影响。同时在细胞与支架共培养21d后进行茜素红染色，检测成骨分化晚期钙结节的形成，观察到等离子喷涂组的钙结节更多，钙结节从中心区域呈放射状，部分结节出现融合趋势且颜色较深；而电化学沉积组的钙结节相对较少，颜色较浅，说明等离子喷涂组羟基磷灰石涂层有力介导了骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化并产生更多的钙结节。

qRT-PCR可以准确检测细胞特定基因的实时表达情况，因此实验采用qRT-PCR检测骨髓间充质干细胞与钛支架共培养7,14d后Runx2、Ⅰ型胶原蛋白、骨桥蛋白、骨钙蛋白成骨基因的表达水平。Runx2为成骨标志基因，标志了细胞成骨分化的开始，同时介导Ⅰ型胶原蛋白的合成，可调节间充质干细胞分化为成骨细胞[34]。Ⅰ型胶原蛋白在骨组织中广泛存在，故Ⅰ型胶原蛋白在成骨分化中细胞基质的形成与成熟阶段起重要作用。骨钙蛋白、骨桥蛋白是晚期成骨阶段矿化的标志。实验发现，等离子喷涂组第7天的Runx2与第7,14天的Ⅰ型胶原蛋白表达均显著高于电化学沉积组，而骨钙蛋白、骨桥蛋白的表达趋势几乎一致，在成骨分化晚期两组间存在显著差异，符合细胞成骨分化中骨钙蛋白、骨桥蛋白的表达趋势。证明在骨髓间充质干细胞成骨分化的早期及晚期阶段，等离子喷涂组羟基磷灰石涂层得益于较厚的涂层厚度、平整且连续的形貌，促使更多的微小羟基磷灰石颗粒与细胞接触并直接促进了细胞的成骨分化。

总之，实验通过电化学沉积与等离子喷涂技术在3D打印钛支架上制备了羟基磷灰石涂层，研究不同工艺制备的羟基磷灰石涂层形貌对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响，结果证实电化学沉积和等离子喷涂制备的羟基磷灰石涂层均未影响3D打印钛支架的原有孔径，两种工艺制备的羟基磷灰石形貌完全不同，不同的形貌对骨髓间充质干细胞的生物学行为产生不同影响，其中等离子喷涂制备的羟基磷灰石涂层形貌更有利于骨髓间充质干细胞的增殖、黏附、成骨分化，为下面进一步分析两种羟基磷灰石涂层的结构构成、材料表征及动物体内实验提供依据。

作者贡献：孙阳进行实验设计，实验实施为孙阳、罗鸣然，实验评估为孙阳、郑力，资料收集为孙阳、胡维帆，孙阳成文，孙阳审校。

经费支持：该文章接受了“江苏省自然科学基金(BE2016647)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：该文统计学方法已经徐州医科大学生物统计学专家审核。

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孙阳,罗鸣然,郑力,胡维帆,袁峰.等离子喷涂与电化学沉积羟基磷灰石涂层形貌对骨髓间充质干细胞的影响[J].中国组织工程研究,2021,25(28):4516-4522.

基金:江苏省自然科学基金(BE2016647),项目负责人:袁峰