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基于DIALC-MS对脓毒症患者外周血差异蛋白的研究分析

2020-10-09 110 上传者：管理员

摘要：目的：基于数据非依赖性采集高分辨率色谱-质谱技术（DIALC-MS）对脓毒症患者外周血差异蛋白进行研究分析，为患者临床治疗提供参考。方法：选择南方医科大学南海医院以及中山大学附属第五医院2018年8月至2019年8月重症监护室收治的60例脓毒症患者作为观察组，同时选取上述两所医院同一时期重症监护室收治的非脓毒症患者作为对照组，采用DIALC-MS对患者外周血差异蛋白进行研究，采用主成分分析法（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）以及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）进行模式识别，确定差异蛋白后进行通路分析以及GO分析，利用PLS-DA模型变量的重要性投影（VIP值）筛选可能的蛋白标志物，同时对贡献最大的蛋白进行ELISA验证以及ROC曲线分析。结果：两组患者共获得530391个碎片离子，63378个肽段，7104个蛋白；60个DIA标本采用Skyline共筛选鉴定得到147363个碎片离子，21840个肽段，6213个蛋白。将碎片离子加和，共得到357个差异蛋白，其中93个高表达，264个低表达。对这357个差异蛋白进行GO分析显示，富集最多的细胞组分是细胞外泌体、细胞膜以及细胞质；受体介导内吞、细胞黏附反应以及血小板脱颗粒可能与脓毒症的发展密切相关；在对这些差异蛋白进行KEGG分析后显示，细菌侵袭上皮细胞、代谢通路、碳代谢通路、血小板激活、补体以及凝血瀑布这几条通路与脓毒症的发展密切相关，并且利用VIP值共筛选出138个差异蛋白，对其中贡献最大的高迁移率蛋白（HMGB-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）以及基质金属蛋白酶-8(MMP-8）进行ELISA验证后显示，观察组患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表达水平明显高于对照组，两组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。将两组患者外周血单个核细胞进行ELISA检测后建立ROC曲线诊断模型显示，HMGB-1灵敏度为0.832，特异度为0.865;NGAL灵敏度为0.802，特异度为0.668;MMP-8灵敏度为0.833，特异度为0.866。结论：基于DIALC-MS技术对脓毒症患者外周血差异蛋白进行研究后显示，PLS-DA、OPLS-DA以及PCA模式能够分析蛋白质组学数据，初步筛选出HMGB-1、NGAL以及MMP-8是脓毒症患者外周血单个核细胞的候选生物标志物。

关键词：
外周血单个核细胞
炎症免疫
脓毒症
蛋白质组学
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脓毒症作为一种由于感染引起的全身炎症反应综合征，它是严重创伤、烧伤、感染以及外科大手术常见并发症，并且随着病情进展可能导致患者出现器官功能障碍以及循环障碍，进一步发展还可能引起患者脓毒症休克，危及生命安全，因此研究脓毒症发病机制对于掌握患者病情进展情况，挽救患者生命有着重要意义[1,2,3]。外周血作为人体免疫系统的重要组成部分，其单个核细胞既能够有效反映宿主的免疫情况，又相对容易获取，因此观察外周血单个核细胞变化情况对研究脓毒症的发展有着重要指导意义[4,5]。随着近年来医学技术的发展，基于质谱的蛋白质组学已经成为研究复杂高通量小分子蛋白的主流工具，而数据非依赖（DIA）技术则是通过对所有母离子选择、碎裂，采集母离子的全部离子信息，能够大规模、高通量地做到相对定量和绝对定量。为此，南方医科大学南海医院以及中山大学附属第五医院基于数据非依赖性采集高分辨率色谱-质谱技术（DIALC-MS）对脓毒症患者外周血差异蛋白进行研究分析，现报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选择南方医科大学南海医院以及中山大学附属第五医院2018年8月至2019年8月重症监护室收治的60例脓毒症患者作为观察组，同时将上述两所医院同一时期入住重症监护室的术后未并发脓毒症的60例患者作为对照组。纳入标准：（1）患者存在明确感染证据，序贯器官衰竭评估（SOFA评分）变化≥2;(2）患者家属知情并签署同意书。排除标准：（1）患者存在自身免疫疾病；（2）合并严重肝、肾功能不全者；（3）患者近半年内使用过免疫抑制药物。观察组中男33例，女27例；年龄35～79岁，平均（61.5±4.8）岁；肺部感染24例，腹腔感染12例，泌尿系感染15例，其他部位感染19例。对照组中男31例，女29例；年龄34～76岁，平均（61.2±4.7）岁。两组研究对象在性别、年龄方面差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2方法

1.2.1细胞蛋白标本制备

疑似脓毒症患者在重症监护室发生高热后，留取高热血培养的同时取外周静脉血5mL，床边EDTA管抗凝，于4h内送至实验室分类提取外周血单个核细胞。

1.2.2质谱蛋白标本制备

在BCA法测定患者蛋白水平后取50μg蛋白，加入6mol/L尿素反应30min,55℃下加入5mmol/LTCEP还原反应30min，然后加入碘乙酰胺控制水平为6.25mmol/L，避光反应1h，加入碳酸氢铵稀释后再加入1mmol/L氯化钙，碱性环境中使胰酶变性，37℃下反应16h，除盐后冷冻干燥。

1.2.3采集质谱数据

采用EASYnLC-1000UPLC系统联合Orbitrap质谱检测器Q-Exactiveplus质谱仪进行数据采集，上样量1μg，在同一根自制C18分析柱上进行。分离相：A相为0.1%甲酸，B相为0.1%甲酸加80%乙腈，环境温度控制在4℃。梯度洗脱程序：0～5min,A相97%～93%,B相3%～7%;>5～55min,A相93%～78%,B相7%～22%;>55～65min,A相78%～65%,B相22%～35%;>65～68min,A相65%～20%,B相35%～80%;>68～75min,A相20%,B相80%。

1.2.4质谱方法

DDA扫描：采用正离子扫描，范围为400～1200m/z，时间75min。一级扫描模式为全扫描，范围为400～1200m/z，一级检测轨道分辨率70000FWHM@200m/z；自动增益控制为3×106，最长注射离子时间为50ms，电荷数2～7,loopcount20，二级质谱碎裂模式HCD，碰撞能量NCE为27%，二级自动增益控制为5×105。DIA数据采集：一级扫描模式为全扫描，范围为400～1200m/z，一级检测轨道分辨率35000FWHM@200m/z,AGC为5×105，窗口为32个固定窗口，每个窗口分别为选择、碎裂、采集母离子和全部子离子信息用于定量。

1.2.5数据及生物信息分析

DDA数据采用软件ProteomeDiscoverer进行搜库，结果导入软件Skyline建库并进行数据分析提取。将筛选出的差异蛋白在DAVID生物信息数据库中作KEGG通路分析、GO分析，从蛋白质的生物过程、分子功能、细胞组分进行基因富集分析。

1.2.6蛋白验证

采用双抗体夹心酶免疫分析法（ELISA）测定外周血单个核细胞中生物标志物的含量，试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3统计学处理

采用R软件（version3.2.2）对碎片离子数据进行主成分分析法（PCA）、偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）以及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）进行模式识别，并对模型进行评价；通过PLS-DA模型变量的重要性投影（VIP值）标志筛选候选差异蛋白，VIP值>1，差异蛋白有意义。建立受试者工作特征（ROC）曲线诊断模型，分析指标诊断效能。采用SPSS18.0软件进行数据处理，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1差异蛋白的筛选

两组患者共获得530391个碎片离子，63378个肽段，7104个蛋白；60个DIA标本采用Skyline共筛选鉴定得到147363个碎片离子，21840个肽段，6213个蛋白。将碎片离子加和，共得到357个差异蛋白，其中93个高表达，264个低表达。为了更直观地显示不同差异蛋白在不同标本间的表达差异，可根据显著性差异蛋白表达量在标本间进行层次聚类。

2.2GO分析和通路分析

对这357个差异蛋白进行GO分析显示，富集最多的细胞组分是细胞外泌体、细胞膜以及细胞质，见图1A；聚类到最多的生物功能是受体介导内吞、细胞黏附反应以及血小板脱颗粒，见图1B，这些功能可能与脓毒症的发展密切相关；最多见的分子功能是蛋白结合、poly(A)RNA结合、细胞黏附以及铁离子结合，见图1C；在对这些差异蛋白进行KEGG分析后显示，细菌侵袭上皮细胞、代谢通路、碳代谢通路、血小板激活、补体以及凝血瀑布这几条通路与脓毒症的发展密切相关，见图1D。

图1差异蛋白GO分析和通路分析

2.3差异蛋白的验证

对357个差异蛋白进行VIP值筛选，共筛选出138个差异蛋白，其中贡献最大的分别是高迁移率蛋白（HMGB-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）以及基质金属蛋白酶-8(MMP-8），在进行ELISA验证后显示，观察组患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表达水平明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1两组患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表达水平比较

2.4ROC曲线诊断模型

将两组患者外周血单个核细胞进行ELISA检测后建立ROC曲线诊断模型显示，HMGB-1灵敏度为0.832，特异度为0.865;NGAL灵敏度为0.802，特异度为0.668;MMP-8灵敏度为0.833，特异度为0.866。

3、讨论

目前脓毒症的发病机制尚不明确，但是临床研究显示免疫紊乱是脓毒症发病的关键因素[6,7]。患者一旦发病后病情进展迅速，临床救治困难，这也是导致危重症患者死亡的首要因素，研究显示并发心肌损害更严重影响到患者临床预后，近40%的患者会出现不同程度的心肌损害，尤其是在新生儿败血症中更易出现，一旦出现心血管并发症，患者病情就会急剧恶化，病死率可上升至70%～90%，因此了解脓毒症的发病机制对于挽救患者生命安全有着重要意义[8]。

本研究显示，在对两组患者检测后共获得530391个碎片离子，63378个肽段，7104个蛋白；60个DIA标本采用Skyline共筛选鉴定得到147363个碎片离子，21840个肽段，6213个蛋白。将碎片离子加和，共得到357个差异蛋白，其中93个高表达，264个低表达。正是这些蛋白的生物作用引发了促炎因子的释放，加剧了患者脓毒症的进展，因此通过蛋白质组学的方法可以更加直观地了解脓毒症的发病机制[9,10]。

研究发现脓毒症的发展与多种通路有关，免疫调节系统紊乱导致机体严重感染应答失调，免疫调控由过度的免疫激活进展至致死性免疫抑制。在对357个差异蛋白进行GO分析显示，富集最多的细胞组分是细胞外泌体、细胞膜以及细胞质；聚类到最多的生物功能是受体介导内吞、细胞黏附反应以及血小板脱颗粒，这些功能可能与脓毒症的发展密切相关。最多见的分子功能是蛋白结合、poly(A)RNA结合、细胞黏附以及铁离子结合。在对这些差异蛋白进行KEGG分析后显示，细菌侵袭上皮细胞、代谢通路、碳代谢通路、血小板激活、补体以及凝血瀑布这几条通路与脓毒症的发展密切相关[11,12]。而HMGB-1作为一种晚期炎症递质，它的主动分泌和被动释放能够诱发患者出现局部炎症，激发细胞因子超表达，加剧炎性反应。而凋亡细胞的二次坏死释放HMGB-1能够级联加剧单核/巨噬细胞的致炎反应，因此脓毒症患者外周血单核细胞HMGB-1的高表达可能与免疫细胞炎症的启动与维持，以及炎症放大的级联反应存在密切联系。NGAL作为急性肾损伤的生物标志物之一，它由肝脏细胞和免疫细胞分泌，与细菌生长和组织分化有密切关系，NGAL的升高可能与宿主感染细菌时自身免疫抗菌作用有关。MMP-8在正常情况下水平极低，它能够激活巨噬细胞中NF-κB促炎性转录因子，炎症条件下MMP-8表达的升高导致患者组织的破坏[13,14]。本研究显示，对357个差异蛋白进行VIP值筛选，共筛选出138个差异蛋白，其中贡献最大的分别是HMGB-1、NGAL以及MMP-8，在进行ELISA验证后显示，脓毒症患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表达水平明显高于非脓毒症患者，并且HMGB-1灵敏度为0.832、特异度为0.865,NGAL灵敏度为0.802、特异度为0.668,MMP-8灵敏度为0.833、特异度为0.866，对患者临床诊治具有一定指导意义。

综上所述，基于DIALC-MS技术对脓毒症患者外周血差异蛋白进行研究后显示，PLS-DA、OPLS-DA以及PCA模式能够分析蛋白质组学数据，初步筛选出HMGB-1、NGAL以及MMP-8作为脓毒症患者外周血单个核细胞的候选生物标志物。

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