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葡萄果实发育过程中葡萄籽中黄烷-3-醇及其聚合体研究

2020-10-31 81 上传者：管理员

摘要：以“黑比诺”酿酒葡萄为试材,采用高效液相色谱检测方法,研究了葡萄果实发育过程中葡萄籽中黄烷-3-醇类单体及其聚合体的动态变化趋势,以期为葡萄最佳采收期和酿造工艺优化提供参考依据。结果表明:“黑比诺”葡萄籽中的黄烷-3-醇单体主要由(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素和(-)-表儿茶素没食子酸酯组成;果实转色之前黄烷-3-醇单体以(+)-儿茶素的占比较高,而之后则以(-)-表儿茶素占据较高比例。在果实发育过程中,葡萄籽中的黄烷-3-醇单体及其聚合体在不同时期达到峰值,其中单体在转色期附近达到峰值,而原花色素则在转色前1周左右达到峰值。“黑比诺”葡萄籽中原花色素末端单元和延伸单元均主要是由(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素和(-)-表儿茶素没食子酸酯组成。末端单元和延伸单元达到峰值的时期也不同,末端单元在转色后2周左右达到峰值,而延伸单元则在转色前1周左右达到峰值。葡萄果实发育过程中,原花色素的平均聚合度总体呈下降趋势。

关键词：
原花色素
果实发育
葡萄
葡萄品种
葡萄籽
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作为一类重要的酚类物质,葡萄果实中的黄烷-3-醇单体及原花色素(黄烷-3-醇多聚体)含量、结构、聚合度、没食子酰化度等对葡萄酒感官特性,如色泽、澄清度、酒体、苦味、涩味以及陈酿潜力等都具有非常重要的影响[1,2,3]。葡萄酒中的这类酚类物质主要来源于葡萄皮和种子,发酵过程中通过皮渣浸渍作用等进入葡萄酒中[4]。葡萄原料中这类酚类物质的含量、聚合度、结构等会因葡萄品种、不同组织部位、葡萄成熟度等而有差异,其中葡萄籽中黄烷-3-醇单体及其聚合体的含量相对较高,其次是葡萄皮[5,6,7]。

葡萄采收时各部分浆果组织中,尤其是葡萄皮和葡萄种子中的风味成分的含量及分布情况会影响到葡萄的质量,并与后期选择的酿造工艺密切相关[8,9]。因此,对葡萄果实发育过程中风味成分的积累及转化,尤其是对与葡萄酒感官特征密切相关的酚类物质进行研究,对于获得优质原料、指导葡萄园采收和酿酒工艺具有重要意义。该研究以红色酿酒葡萄“黑比诺”为试材,研究分析了葡萄果实发育过程中葡萄籽中黄烷-3-醇类酚类物质的动态变化趋势,以期为制订合理的采收计划和酿造工艺提供参考依据。

1、材料与方法

1.1试验材料

葡萄采样:选用“黑比诺”酿酒葡萄作为试材,于2017年4月采自新西兰林肯大学葡萄种植基地。选取30株葡萄,从葡萄转色期前3周,每周随机采摘5穗葡萄,转色期之后每2周采样一次,直到葡萄成熟,采收的果穗于4℃保存,1周内进行分析,在果穗不同部位摘取10～15粒葡萄。

供试试剂:色谱试剂均为HPLC级;乙腈、甲醇、丙酮、甲酸、冰乙酸、抗坏血酸、盐酸、三氟乙酸、无水醋酸钠,购自美国Fisher公司;(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素、间苯三酚,购自美国Sigma-Aldrich公司;ToyopearlHW-50(F),购自日本Tosoh公司;试验用水为超纯水(电导度18M)。

供试仪器:Waters2695高效液相色谱仪,Waters2996光电二极管阵列检测器(PDA),美国Waters公司;MultifugeX1R台式高速冷冻离心机,美国ThermoFisher公司;EyelaN1100旋转蒸发仪,日本Eyela公司;LabconcoCentrivap真空离心浓缩仪,美国Labconco公司;ChristAlpha1-4LSCplus冷冻干燥机,德国Christ公司。

1.2试验方法

1.2.1葡萄籽中酚类物质提取

参考KENNEDY等[10]的方法,并稍作修改。取10粒葡萄,称质量,分离葡萄籽,用双蒸水冲洗。葡萄籽数粒,称质量,冷冻干燥,重新称质量。分别放入具塞离心管中,加入1mL·g-1的丙酮∶水(2∶1,v/v)提取液,室温避光振荡提取24h。提取液低温离心15min,上清液进行真空旋蒸,冻干成粉。用1mL甲醇重溶,置于2mL棕色样品瓶中,-20℃冷冻保存备用。

1.2.2黄烷-3-醇单体HPLC分析条件

参考温鹏飞等[11]的方法,并稍作修改。德国Merck公司LiChrospher100RP-18e(250mm×4mm,5μm),保护柱为RP-18(10mm×4mm),紫外检测波长为280nm,柱温30℃,进样量10μL,流速1.0mL·min-1,外标法定量。梯度洗脱:流动相A为水,流动相B为冰乙酸(90∶10v/v)。洗脱程序:0～7min,7.5%B;7～20min,7.5%～65%B;20～30min,65%～80%B;30～48min,80%～90%B;48～55min,90%B;55～63min,7.5%B。

1.2.3葡萄籽中原花色素分离纯化

参考KENNEDY等[10]的方法,并稍作修改。粗提取物冻干粉用色谱柱ToyopearlHW-50(F)进行进一步分离纯化。ToyopearlHW-50(F)(350mm×80mm)先用1∶1的甲醇∶水溶液(含0.1%v/v三氟乙酸)平衡活化。然后将粗提物冻干粉用上述流动相重溶,上柱。先用5个柱体积的流动相洗柱,然后用3个柱体积的2∶1丙酮∶水溶液(含0.1%v/v三氟乙酸)洗脱。得到的丙酮洗脱液进行真空旋蒸,冻干成粉。用1mL甲醇重溶,置于2mL棕色样品瓶中,-20℃冷冻保存备用。

间苯三酚酸降解反应:取100μL甲醇重溶液,加入100μL间苯三酚反应试剂(1∶1),50℃水浴反应20min后,加入200μL0.2mol·L-1醋酸钠溶液,终止反应。间苯三酚反应试剂配制:0.2mol·L-1盐酸甲醇溶液,含100g·L-1间苯三酚和20g·L-1抗坏血酸。

1.2.4葡萄籽中原花色素HPLC分析条件

HPLC分析方法参考DUCASSE等[12]的方法,并稍作修改。WatersAtlantisdC18(250.0mm×4.6mm,5μm)色谱柱,Waters保护柱(20.0mm×4.6mm,5μm),紫外检测波长为280nm,柱温30℃,进样量10μL,流速0.8mL·min-1,以(+)-儿茶素为标品,外标法定量。梯度洗脱:流动相A:水∶甲酸(98∶2,v/v),流动相B:乙腈∶流动相A(80∶20,v/v)。洗脱程序:0～5min,0%B;5～35min,0%～10%B;35～70min,10%～20%B;70～75min,20%～100%B;75～80min,100～0%B。

1.3数据分析

试验数据采用SPSS18.0统计软件进行分析。

2、结果与分析

2.1果实发育过程中葡萄籽中黄烷-3-醇单体的变化

由图1可知,“黑比诺”种子中检测到了儿茶素(CAT)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG);在葡萄果实发育过程中,葡萄籽中的黄烷-3-醇单体总量持续上升,到转色期附近达到最高值(4480.5nmol·籽-1),然后开始下降,到成熟期后逐渐趋于稳定;从转色期到收获期,单体总含量下降了约60%;从转色前3周到转色期,CAT和EC的增长速率较快,ECG相对较缓慢。

从图1还可以看出,随着果实的发育,葡萄籽中黄烷-3-醇单体种类所占比例也在发生变化。最初,在转色前3周,CAT、EC和ECG的占比分别是39%、44%和17%(mol%),到转色时分别为47%、43%、10%,相对于其它2个组分,CAT的比例呈上升趋势。然而转色期之后,趋势发生了变化,EC的占比开始上升,到采收期时,CAT、EC和ECG三者的占比分别大约为38%、58%、4%。前人曾在“黑比诺”葡萄上研究报道过相似趋势[13];也曾经有研究人员在其它葡萄品种上报道过类似趋势[8,9,14]。

图1果实发育过程中葡萄籽中黄烷-3-醇单体的含量变化

2.2果实发育过程中葡萄籽中原花色素(黄烷-3-醇聚合体)末端单元的变化

从图2可以看出,“黑比诺”葡萄籽中原花色素末端单元主要是由tCAT、tEC、tECG组成;末端单元在转色后2周左右达到最高值(1708.5nmol·籽-1),随后快速下降,接近成熟期时趋于稳定,采收时达到1120.8nmol·籽-1,约为最高峰时的70%左右。tCAT转色前3周左右为612.4nmol·籽-1,采收期时下降到582.4nmol·籽-1,转色期后2周左右达到最高峰901.6nmol·籽-1;tEC总体呈上升趋势,转色前3周左右为122.4nmol·籽-1,采收期时上升为341.6nmol·籽-1,转色期后2周左右达到高峰472.6nmol·籽-1;tECG从转色前3周的285.6nmol·籽-1,缓慢下降到了采收期的196.8nmol·籽-1。

在整个果实发育期,tCAT基本占到了葡萄籽原花色素末端单元的55%左右(mol%),转色期前3周ECG占到了总末端单元的30%左右,到采收期其比例下降到了18%左右,而EC的比例则反增到了30%左右。

图2果实发育过程中葡萄籽中原花色素末端单元的变化

2.3果实发育过程中葡萄籽中原花色素延伸单元的变化

从图3可以看出,“黑比诺”葡萄籽中原花色素延伸单元主要由eCAT、eEC、eECG组成;延伸单元在转色前1周左右达到最高值(9602.5nmol·籽-1),随后逐渐下降,其中eCAT和eECG的下降速率相对较为缓慢;整个果实发育期,葡萄籽中原花色素各延伸单元的占比变化不大,其中以eEC为主,转色时,eCAT、eEC和eECG三者的占比分别为7.4%、76.8%、15.8%;到采收期时,eCAT、eEC和eECG三者的占比分别为8.1%、77%、14.9%(mol%)。

图3果实发育过程中葡萄籽中原花色素延伸单元的变化

2.4果实发育过程中葡萄籽中原花色素平均聚合度的变化

从图4可以看出,葡萄果实发育过程中,原花色素的平均聚合度总体呈下降趋势,从转色前3周的9.3下降到采收期的6.7,前期下降速度较快,接近成熟期时速率变慢,并逐渐趋于稳定。

图4果实发育过程中葡萄籽中原花色素平均聚合度的变化

2.5果实发育过程中葡萄籽中总原花色素含量的变化

图5果实发育过程中葡萄籽中总原花色素的变化

从图5可以看出,“黑比诺”葡萄籽中原花色素亚单元总浓度从转色前3周的9750.8nmol·籽-1开始一直呈上升趋势,到转色前1周左右达到最高值10950.6nmol·籽-1,之后开始下降,最初下降较为缓慢,而转色2周后,下降速率开始变大,随后接近成熟期时趋于稳定,这一变化趋势与前人研究结果一致[14,15],包括转色前的积累情况以及转色期之后的下降趋势,曾经有研究人员认为转色期之后原花色素的下降可能是与氧化有关,这需要进一步进行研究。

3、结论

“黑比诺”葡萄籽中的黄烷-3-醇单体主要由儿茶素(CAT)、表儿茶素(EC)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)组成。在果实发育过程中,葡萄籽中的黄烷-3-醇单体总量在转色前不断累积上升,之后则进入下降通道。随着果实发育,黄烷-3-醇单体的占比也在发生变化,转色之前单体以CAT的占比较高,而之后则转以EC占据较高比例,ECG始终占比最少。

与黄烷-3-醇单体一样,“黑比诺”葡萄籽中原花色素的总含量主要也分为累积期和下降期,转色前1周左右达到峰值。葡萄果实发育过程中,原花色素平均聚合度mDP总体呈下降趋势。

“黑比诺”葡萄籽中原花色素末端单元和延伸单元均主要是由CAT、EC、ECG组成。果实发育过程中,末端单元的摩尔含量在转色后2周左右达到峰值,之后开始下降,接近成熟期时趋于稳定。不同末端单元的摩尔含量随着果实发育变化趋势有所不同,其中CAT在转色后2周左右累积达到峰值,之后开始迅速下降;EC也在转色后2周左右达到峰值,但总体呈上升趋势,而ECG没有明显峰值,且总体呈下降趋势。与末端单元不同的是,延伸单元的摩尔含量在转色前1周左右达到峰值,随后逐渐下降;整个果实发育期,各延伸单元的占比变化不大,其中EC的占比始终最高,达到70%以上(mol%)。

该研究中葡萄种子中黄烷-3-醇及其聚合体的总体变化规律分为转色前的累积以及转色期之后的下降趋势,而导致这种变化的因素还有待于更深入分析,此外对于不同品种、不同年份之间的动态变化也有待于进一步研究。

参考文献：

[1]曹鹏,段长青.葡萄果实和葡萄酒中缩合单宁的研究进展[J].农业工程学报,2004,20(增刊):5-12.

[2]张振文,宁鹏飞,张军贤,等.葡萄酒缩合单宁测定方法的比较研究[J].食品科学,2012,33(20):233-237.

[11]温鹏飞,陈建业,李景明,等.葡萄果实中黄烷-3-醇及其聚合体的HPLC检测[J].园艺学报,2006,33(4):714-720.

丁燕,HARRISONRoland,王超萍,韩晓梅,吴新颖.葡萄果实发育过程中葡萄籽中黄烷-3-醇及其聚合体的变化[J].北方园艺,2020(20):16-21.

基金:山东省农业科学院青年英才培养计划资助项目;山东省农业科学院农业科技创新工程资助项目(CXGC2016D01);山东省现代农业产业技术体系果品创新团队济南综合试验站资助项目(SDAIT-06-21);山东自然科学基金资助项目(ZR2019PC062)