牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)属芍药科(Paeoniaceae)芍药属多年生植物,兼具观赏价值和药用价值[1]。近年来,随着观赏牡丹和油用牡丹生产面积的扩大,牡丹根腐病害的发生日益突出,造成大面积植株长势衰弱,甚至整株死亡,严重影响牡丹的观赏效果和后期开发应用效果[2]。2016—2018年的3—5月,对洛阳地区多个牡丹种植地进行病害调查发现,牡丹根腐病是影响牡丹正常生长发育的主要病害种类,尤其是多年连续种植的牡丹观赏园,其植株死亡率极高,造成极大经济损失。因此,准确鉴定牡丹根腐病的致病病原菌,对生产实践中的科学防控具有重要研究和实际意义。

牡丹根腐病为土传病害,又称烂根病,在牡丹的整个生育期均可造成危害。目前研究认为引起牡丹根腐病的病原菌主要为镰刀菌属(Fusarium)真菌,研究者对山东菏泽牡丹园中的根腐病样品中进行病原菌的分离,结果表明引起菏泽地区牡丹根腐病的病原菌为茄病镰刀菌(Fusariumsolani)[3,4,5]。但不同地域不同生态条件下植物病害的病原菌可能存在差异[6]。河南洛阳为中国牡丹品种最为集中、种植规模最大的地区之一,其根腐病的病原菌是否与前人研究报道一致,需做进一步的研究证实。该研究为明确洛阳地区牡丹根腐病的病原,从洛阳地区不同牡丹种植地病株中分离并鉴定根腐病原菌,以期了解洛阳地区牡丹根腐病的病原菌种类,为进一步开展该病害的综合防治奠定理论基础。

1、材料与方法

1.1试验材料

2016—2018年间采集洛阳隋唐城遗址公园牡丹种植区、洛阳国花园、洛阳国家牡丹园、洛阳牡丹研究所牡丹种植基地和洛阳国际牡丹园中发病的牡丹根部样品,共采集病株30份。健康牡丹的侧枝根采自洛阳理工学院牡丹种植地。

1.2试验方法

1.2.1病原菌的分离

病原菌分离纯化采用常规组织分离法[7]。将牡丹病株根部样品用流水洗净,吸水纸吸干水分后切取根部病健交界处组织,75%酒精消毒后,10%的次氯酸钠溶液浸泡10min,灭菌水漂洗3次后接种在PDA培养基上。每皿接种4块,25℃条件下培养。3～4d出现菌落后,挑取菌落边缘进行纯化,依据纯化后的菌落特征分类编号,统计分离物的种类、数量,4℃保存备用。

1.2.2病原菌致病性测定

将获得的分离物接入直径9cm的培养皿中央。挖取约五年生健康牡丹的侧枝根,并剪切为1cm左右的长度,清水冲洗干净,表面消毒,无菌水冲洗,晾干后插入接种分离物的PDA培养基边缘,每个分离物设3次重复;以根尖插入未接种分离物的PDA培养基中为对照,培养4d后观察记录根尖颜色的变化。

1.2.3病原菌形态学鉴定

将具有致病性的菌株接种于PDA培养基,于25℃条件下恒温培养7d,观察记录菌落的颜色、形状、表面特征和边缘生长状况。在光学显微镜下观察记录产孢梗、分生孢子形态、大小、隔膜有无及数目、厚垣孢子的有无及着生方式等特征。

1.2.4病原菌分子生物学鉴定

病原菌基因组DNA的提取:将代表菌株在PDA培养基上培养10d后,用玻璃片刮取菌丝,在60℃烘箱中烘干,采用真菌提取试剂盒(北京索莱宝生物技术有限公司)进行真菌DNA基因组的提取,方法详见说明书,置-20℃保存备用。

病原菌rDNA-ITS序列和EF-1α基因序列的检测:利用病原菌核糖体内部转录间隔区序列和翻译延长因子EF-1α基因序列进行病原菌的分子生物学鉴定。真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增病原菌rDNA-ITS序列[8]。引物TEF1αF(5′-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3′)和TEF1αR(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)扩增病原菌EF-1α基因[9]。扩增体系为50μL,PCR反应程序:94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃1min,30个循环;72℃10min;4℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,DNA片段经凝胶回收试剂盒(天根生物工程有限公司)回收,回收产物委托上海生工生物工程公司进行测序。

rDNA-ITS和EF-1α基因序列分析:测出的序列人工校对后除去前后测序质量较低序列,然后将获得的ITS序列和EF-1α基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较,确定与该菌株亲缘关系最近的种属。

1.3数据分析

从数据库获得相关种属的序列,用ClustalX软件进行序列的比对排列,利用MEGA7软件中邻接法(neighbour-joiningmethods,NJ)构建聚类分析树状图,分析该菌与同属其它菌株的亲缘关系,以确定其分类地位。

2、结果与分析

2.1病害症状的观察

牡丹根腐病是牡丹栽培过程中发生严重的一种土传病害,该病害主要危害牡丹根部,牡丹连作时间越长,其病害发生越严重。在洛阳地区其病害症状主要表现为3—4月植株地上部分长势衰弱,叶片失绿、发黄,变小,有的叶肉变黄色(图1A);5—6月植株地上部分因失水枯萎出现青枯症状(图1B);发病植株地下部分主要表现为支根和须根染病后变黑腐烂,逐渐向主根扩展,主根感病初期在根表皮上产生不规则黑斑,且不断横向扩展,致使大部分根表皮变黑(图1C)。

2.2分离物致病性测定

利用组织分离法从30份牡丹根腐病株中共分离获得15株病原真菌分离物,依次命名为MRR1-MRR15。采用离体根尖接种的方法检测分离物的致病性,致病性检测结果表明9株分离物MRR3、MRR4、MRR5、MRR6、MRR8、MRR9、MRR10、MRR13和MRR14能够使接种在PDA平板上的牡丹根尖变黑,且菌丝生长旺盛,将根尖变黑部位的菌丝重新分离,能够获得与病原物菌落形态一致的菌落,表明这9株病原菌分离物能够引起牡丹根腐病的发生,而不具有致病性的病原菌分离物,仅有根尖前段部分变褐,且无菌丝明显生长迹象,表明菌丝无法侵入根尖组织,造成组织变黑,即接种培养基的根尖,在接种前后无明显变化(图2)。

图1牡丹根腐病田间发病症状

图2牡丹根腐病病原菌分离物的致病性检测

2.3病原菌分离物形态学观察

对9个具有致病性的病原菌分离物进行形态学观察,根据菌落形态特征、分生孢子的大小和形态及产孢细胞的形态,初步将9个分离物归为2种类型,选择2种类型的代表性病原菌分离物MRR3和MRR13形态特征进行描述。分离物MRR3的菌落生长速度较快,PDA培养基上25℃培养4d后,菌落直径为4.5cm,菌落白色、繁茂、致密、微微发紫,菌丝放射状生长,气生菌丝绒状,菌落背面呈紫色。小型分生孢子较多,卵形或肾形,0～1个隔膜,假头状着生在产孢细胞上大小为(4.8～10.1)μm×(2.0～4.6)μm;大型分生孢子镰刀形,较匀称,足细胞明显,具3～5个隔膜,大小为(20.2～36.6)μm×(3.3～4.5)μm(图3A～B);产孢细胞单瓶梗,较短(图3C),厚垣孢子球形,表面光滑,单生、双生或聚生于菌丝间(图3D)。分离物MRR13的菌落在PDA培养基上25℃培养4d后,菌落直径为3.5cm,菌落平铺,全缘,呈圆形,白色,气生菌丝绒状,后期菌落中央浅黄褐色。在气生菌丝上长出的产孢细胞为菌丝形的单瓶梗,产孢梗长(图4A);小型分生孢子卵形或肾形,比较宽,0～1分隔,多为1隔。大小为(7.6～17.7)μm×(2.1～5.4)μm。明显比其它种类镰刀菌的小型分生孢子粗胖;大型分生孢子马特型,两端较钝,顶细胞稍弯,基细胞钝圆形或足跟不明显,整个孢子形态较短较胖,大小(23.7～37.7)μm×(3.7～6.4)μm(图4B～C);厚垣孢子球形,表面光滑,单生、双生或聚生于菌丝间(图4D)。

图3病原菌分离物MRR3的形态学特征

图4病原菌分离物MRR13的形态学特征

2.4致病性病原菌分离物rDNA-ITS基因序列分析

用通用引物ITS1和ITS4对致病性病原菌MRR3、MRR4、MRR5、MRR6、MRR8、MRR9、MRR10、MRR13和MRR14的rDNA-ITS序列进行扩增,均获得约500bp的ITS序列,其序列在NCBI上的登录号为MN461531、MN461532、MN461533、MN461534、MN461535、MN461536、MN461537、MN461538和MN461539。将获得的ITS序列与NCBI中已有序列进行比较,分离物MRR3的ITS序列与尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的相似度达到99%以上,分离物MRR4、MRR10、MRR13和MRR14的ITS序列与茄病镰刀菌(Fusariumsolani)达到相似度为99%以上,分离物MRR5、MRR6、MRR8和MRR9的ITS序列与茄病镰刀菌(F.solani)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的相似度均在99%以上,在GenBank数据库中选取与分离物同源性较高ITS序列,Neonectriaramulariae作为外群,利用MEGA7软件中邻接法(neighbor-joiningmethods,NJ)构建聚类分析树状图。由图5可知,分离物与其同源性较高的菌株聚为一组,但ITS序列对茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌的区分度不够明显,对外群的区分度也不明显,结果表明仅利用ITS序列区别镰刀菌属的不同种类其信息量是不够的。

图5基于ITS序列构建的牡丹根腐病原菌分离物的系统发育树

2.5致病性病原菌分离物EF-1α基因序列分析

利用功能基因EF-1α的扩增引物对致病性病原菌分离物MRR3、MRR4、MRR5、MRR6、MRR8、MRR9、MRR10、MRR13和MRR14的EF-1α基因序列进行扩增,均获得约700bp的基因序列,其序列在NCBI上的登录号分别为MN977909、MN977910、MN977911、MN977912、MN977913、MN977914、MN977915、MN977916和MN977917。对所测序列进行比对校正后,与NCBI中已有序列进行比较,并选取与病原菌分离物同源性较高的基因序列,Neonectriaramulariae作为外群。利用MEGA7软件中邻接法(neighbor-joiningmethods,NJ)构建聚类分析树状图,由图6可知,EF-1α基因序列可将茄病镰刀菌(F.solani)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)显著区分,致病性分离物MRR3和MRR8与尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的同源性最高,聚为一组,分离物MRR4、MRR5、MRR6、MRR9、MRR10、MRR13和MRR14与茄病镰刀菌(F.solani)的同源性最高,聚为一组,外群Neonectriaramulariae也被明显区分。结果表明利用功能基因EF-1α序列构建的系统发育树,能够准确鉴定引起牡丹根腐病的病原菌,其中7株分离物被鉴定为茄病镰刀菌(F.solani),2株分离物被鉴定尖孢镰刀菌(F.oxysporum)。

图6基于EF-1α基因序列构建的牡丹根腐病原菌分离物的系统发育树

3、讨论与结论

根腐病是植物生长过程中一类常见的毁灭性土传病害,素有“植物癌症”之称[10],尤其是在长年连作的植物上危害严重,牡丹作为一种连作植物,其根腐病的发生也极为严重,且根治困难,给牡丹产业的发展带来极大的障碍[11]。研究者对多种植物根腐病的病原菌进行调查研究,结果表明镰刀菌属真菌是引起植物根腐病发生的主要致病菌,其中以茄病镰刀菌(F.solani)最常见[12];同时研究表明,植物根腐病可由病原菌单独侵染或复合侵染导致,其中复合侵染是主要模式,以不同营养方式生活的病原菌可以复合模式侵染植株,因此增加了根腐病防治的困难性[13]。2016—2018年,该课题组从洛阳不同牡丹种植区采集牡丹根腐病样品,进行病原菌的分离,通过致病性检测和病原菌的鉴定,初步确定引起洛阳地方牡丹根腐病的病原菌主要有2种,茄病镰刀菌(F.solani)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum),其中茄病镰刀菌(F.solani)为优势病原菌。

该研究采用离体根尖接种分离物的方法测定病原菌的致病性,具有致病性的病原菌能够引起离体牡丹根尖变黑,且菌丝能够旺盛生长,但由于牡丹栽培的困难性,因此该病原分离物没有接种在活体牡丹植株上进一步确认其致病性,因此该研究仅能够初步确定引起牡丹根腐病的病原菌为茄病镰刀菌(F.solani)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum),要更准确的判定其作为牡丹根腐病的病原菌,需做进一步的研究。

目前研究认为引起牡丹根腐病的病原菌主要为茄病镰刀菌(F.solani)[14,15,16,17],但该研究结果表明,尖孢镰刀菌(F.oxysporum)也能够引起牡丹根腐病的发病,表明牡丹根腐病的发生也是镰刀菌复合侵染的结果,且致病性结果显示二者均可单独致病,但2种镰刀菌的侵染机制及混合接种后牡丹的发病率是否会显著增加均需做进一步的研究和调查。

镰刀菌属真菌种类众多,不同种之间又能表现出相似特征,仅仅依靠形态学对镰刀菌属真菌进行鉴定其准确性较低[18]。随着分子生物技术的飞速发展,利用遗传序列特征进行病原真菌形态特征无法解决的鉴定问题被越来越多地应用,其结果也更加准确和可靠。越来越多的学者也将分子标记技术应用于镰刀菌的分类鉴定中,目前用于镰刀菌鉴定的基因位点主要包括内转录间隔区、线粒体小亚基核糖体、β-微管蛋白及翻译延伸因子等,其中ITS和EF-1α基因在镰刀菌的鉴定中应用最为广泛[19,20,21]。该研究通过真菌ITS序列分析,结合EF-1α基因,将牡丹根腐病的病原菌鉴定为茄病镰刀菌(F.solani)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)。从该研究结果来看,EF-1α基因序列优于ITS序列的区分度,结果表明EF-1α基因序列可以用于镰刀菌属相似种的区分和鉴定。

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基金:国家自然科学基金资助项目(31500008);河南省高等学校重点科研资助项目(20A210028)