牡丹(Paeoniasuffruticosa)属芍药科芍药属多年生落叶亚灌木，具有极大的观赏、油用和药用价值[1]。牡丹繁殖方法有播种、嫁接、分株，近年来对牡丹组织培养的研究也有了较大进展[2,3]。牡丹的种子、芽和组培苗都具有休眠特性[4,5,6]。牡丹种子秋季播下，要经过半年的时间才能萌发，甚至有的种子一直不能打破休眠而萌发，严重阻碍了牡丹种苗产业化的发展。牡丹的组培苗在转入生根培养基后发生休眠，整个植株生长缓慢或停滞，严重降低组培苗的移栽成活率。牡丹植株上的芽在深秋进入休眠状态，必须要经过一段时间的低温才能打破休眠而萌发，要想在春节前使牡丹反季节成花，就必须提前解除休眠。随着国民生活水平的提高，人们对食用油的要求也越来越严格。由于牡丹籽油含有多种人类所必需的不饱和脂肪酸，油用牡丹的研究获得了越来越多人的关注。油用牡丹最常用的繁殖方式为播种繁殖，获得整齐、发育良好的种苗是牡丹籽油产业化的必然趋势，因此，研究牡丹种子、组培苗的休眠特性，寻找解除休眠的方法，对油用牡丹的产业化发展有着重要意义。解除牡丹芽休眠是牡丹反季节成花的必要手段。该研究从牡丹种子和芽的休眠原因、休眠机制、休眠解除的方法以及试管苗休眠系统概述了近年来牡丹休眠的研究进展，为提高牡丹种苗繁殖效率和反季节栽培提供理论依据和技术支持。

1、牡丹种子休眠研究进展

牡丹种子的休眠分为上胚轴休眠和下胚轴休眠，且上胚轴的休眠更加突出[7]。牡丹种子具有深休眠特性，播种后，需要经历6个月的时间才能发芽，这期间种子胚根发育成根而胚芽不生长处于休眠状态。

1.1牡丹种子的休眠原因

1.1.1种皮限制

牡丹种子的种皮较为坚硬，会降低种子的吸水和透气性，不利于种子萌发。仇云云等[8]研究发现紫斑牡丹种皮降低了种子的吸水速率和呼吸速率。木质化的种皮可能会对种子萌发造成一定的阻碍作用[4]。

1.1.2种子内存在抑制萌发的物质

牡丹种子内存在抑制萌发的物质是引起种子休眠的重要原因。郭丽萍[9]通过对牡丹种子浸提液的研究发现，胚乳和种皮浸提液均对白菜种子和自身种子的萌发有一定的抑制作用。牡丹种子胚乳内含有酚类物质，会降低上胚轴细胞分裂的速度，致使上胚轴休眠[10]。‘凤丹’种子内源抑制物主要是酚类物质和有机酸，一些酰胺类物质也是造成‘凤丹’种子生理休眠的内源抑制物[11]。‘凤丹’种子浸提液中含量最高的6种有机物分别是羟基丙酮、苯酚、1,3-二羟基丙酮、糠醛、乙酸和甲酸，这6种有机物都对白菜种子的根长和发芽有不同程度的抑制作用[12]。

1.1.3胚未发育成熟

牡丹种子的种胚发育完全是萌发的前提。牡丹果实外形成熟采摘后，其内部形态并未发育完全，胚根、胚轴、子叶的分化不明显，此时的牡丹种子还没有萌发的能力。没有分化的种胚必须经过分化且达到一定的种胚长度/种子长度，而分化的种胚必须发育完全且达到一定的长度，种子才能萌发[13]。牡丹的种胚在萌发时的长度大约是新鲜成熟种子的2倍[14]。郭丽萍[9]对牡丹种子形态观测的结果表明，沙藏45d时，种胚才能分化出完整的胚轴、胚根和子叶。采摘后的种子胚未发育完全是牡丹种子休眠的重要原因。

1.2牡丹种子休眠相关机理

在休眠的过程中，种子细胞内也在发生着一系列反应。低温处理过程中，GA3和ABA的含量改变不明显，但IAA含量的积累显著增加，上胚轴中GA3/ABA和IAA/ABA的比值是根长影响上胚轴休眠的主要原因[15]。周仁超等[16]认为牡丹种子的萌发生根需要一定的营养，但其胚乳主要为脂类物质，不易水溶，难被胚吸收，GA3的处理可能会使某些脂类物质转化为易被胚吸收的物质，这样胚能够吸收足够的营养，从而促进了胚的生根。牡丹种子的休眠还可能与较高含量的ABA和影响ABA水平的PoNCED1、PoZEP1、PobZIP1基因有关[17,18]。在种子胚根形成期间，‘凤丹’种胚内IAAO活性下降导致IAA含量上升，以促进‘凤丹’种子的生根，F7GT、HSP70、6PGDH、G6PDH、MDH、IDH、FAD2、L3A3等基因表达量的变化影响种子萌发时物质和能量代谢等过程，促进种子最终的萌发[19]。

1.3牡丹种子的休眠解除方法

1.3.1温度

温度对牡丹种子的萌发及胚芽的伸长有着显著的影响。经研究发现，解除上胚轴休眠和下胚轴休眠所需的温度并不相同。‘凤丹’种子需要经历25℃暖温长根阶段和5℃低温长芽阶段；在一定范围内随温度升高，牡丹种子生根率会增加，但高于25℃的恒温处理则对牡丹种子生根不利，且15～25℃的变温处理也可以解除牡丹下胚轴休眠[20,21]。而卢惊鸿[22]认为恒温15℃更有利于加速生根进程，并能提早结束生根。低温只对已生根牡丹种子的上胚轴休眠解除有效，且在根长2～3cm时处理3周可以得到最高的发芽率，低温处理对未生根的种子上胚轴休眠解除无效[7,23]。马宏等[24]发现4℃低温处理根长大于3cm的大花黄牡丹种子40d,发芽率可达80%。

1.3.2外源激素

赤霉素对打破牡丹种子的休眠具有重要作用，可以部分代替低温。适宜浓度的GA3处理可以缩短生根历程，提高生根率，但GA3浓度过高会抑制生根，且不同的牡丹品种促进生根所需要的浓度不同[9,16,21,22,25]。GA3处理也可以解除部分牡丹种子上胚轴休眠。BARTON等[26]认为，赤霉素打破上胚轴的效果与根长有直接关系。经研究发现，适宜浓度的赤霉素处理已生根3～4cm的牡丹种子会优先发芽[21,24,25,27]。

1.3.3种皮处理

挫伤种皮对黄牡丹种子的发芽有一定的促进作用[28]。对种脐端进行破皮处理可以显著提高种子的生根率，经过破皮处理的凤丹和紫斑牡丹的生根率提高到76%和43%,显著大于完整种子和经浓硫酸处理种子的生根率[9]。刘淑敏等[29]发现，用50℃的温水浸泡牡丹种子24h或者浓硫酸浸泡2～3min,均可使牡丹种皮软化，促进萌发。

2、牡丹芽休眠研究进展

2.1牡丹芽休眠特性

牡丹在深秋形成鳞芽以休眠状态度过寒冬。由于在其原产地的系统发育过程中受不良生态因子的影响，休眠要求一定的低温期和低温值，只有感受一定的低温期和低温值，休眠才能解除，条件适宜时才能萌芽、抽枝、发叶、开花，否则，即使把牡丹放在适宜的环境条件下，也不会萌发、生长；不同的牡丹品种或同一植株上不同部位的芽体，解除休眠所需要的低温期和低温值也不同；牡丹芽经历低温休眠被彻底解除之后，即使仍处于低温环境中，芽体也会萌发、生长，只是在低温环境中生长速度很慢[30]。高燕等[31]认为牡丹芽在低温休眠过程中，发育速度缓慢，但不会完全停止。

2.2牡丹芽休眠机理

2.2.1牡丹芽休眠生理机理

内源激素：植物内源激素的变化是检测植物休眠和解除休眠的一个重要信号。低温解除牡丹芽休眠是通过调节休眠解除的促进物和抑制物之间的平衡来实现的，是多因素综合作用的结果[32,33]。在低温解除花芽休眠的过程中，GA3是主要促进因子，ABA是主要抑制因子，ZR和CTK也起着部分解除休眠的作用[34]。休眠的解除主要是取决于GA3与ABA的比值，研究证明GA3/ABA的比值在低温解除休眠的过程中最高且一直处于上升趋势，至花芽休眠解除时比值最高，GA3/ABA比值的变化与休眠的进程直接对应[5,31,33]。

碳水化合物：牡丹花芽解除休眠的过程伴随着可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白等物质的水解，为其早期生长发育提供能量来源。研究发现，可溶性糖和游离氨基酸含量在休眠开始阶段最低，随着低温的累积逐渐上升而后稍有下降，随后又持续上升并保持很高的水平，与淀粉和可溶性蛋白的含量变化趋势正好相反，说明在低温解除休眠过程中，各类营养物质相互转变，以适应不同的生理需求[35,36]。随着休眠的解除，内源GA3含量明显增加，而GA3可以诱发α淀粉酶及某些水解酶的合成，促使淀粉水解为糖，为花芽的代谢活动提供能量[5,35]。

呼吸强度：呼吸强度的变化也反映了牡丹催花的进程。在低温处理过程中，牡丹呼吸强度逐渐上升，解除休眠时达最高值，而后下降[35]。ZHANG等[37]认为0～4℃处理21d植株发芽率和开花率均增加，且总呼吸速率显著提高。

膜脂过氧化水平：膜脂过氧化水平与解除休眠密切相关，MDA(丙二醛)是其终产物。罗玉荣等[38]研究发现随着低温的积累牡丹‘凌花湛露’花芽内MDA含量增加，休眠接近解除时达最高值，之后下降，休眠解除时下降到最低值。盖树鹏[5]认为随着低温处理，牡丹花芽膜脂过氧化水平升高，膜脂透性增加，休眠解除。膜脂过氧化可能作为休眠解除的信号物质在早期起作用。

过氧化酶系与活性氧：过氧化酶系与活性氧的变化与低温解除牡丹花芽休眠的过程密切相关。在这个过程中，SOD、POD、CAT活性和活性氧均有一个增加的过程，活性氧增加的过程会使细胞内部的休眠平衡被打破，决定花芽萌动的基因由沉默变为激活状态，牡丹花芽休眠得以彻底解除[37]。盖树鹏[5]认为活性氧、自由基在低温处理初期迅速上升、保护酶系初期保持较低的活性；休眠基本解除时，活性氧迅速下降，活性氧很可能是牡丹花芽休眠解除的信号。

2.2.2牡丹芽休眠分子机理

甲基化水平：DNA甲基化可能是参与休眠调控的一种重要方式。长期的低温会导致牡丹DNA甲基化降低，牡丹复合芽生长和分化，促进牡丹休眠解除[39,40]。另外，GA3处理显著降低了花芽的甲基化水平，且随着施加GA3天数的增加，花芽甲基化水平呈下降趋势，推测GA3处理通过诱导PsROS1表达、抑制PsDRM表达导致DNA低甲基化，进而促进了牡丹休眠解除，这可能是赤霉素发挥作用的一种重要方式[41]。

基因表达：PsPⅡ基因的作用是在花芽休眠解除过程中通过影响酶活性调节营养类物质的代谢，从而满足花芽休眠解除过程中对营养物质的需求[42]。PsSERK2基因的表达促进了花芽内各个组织细胞分裂频率逐渐增加，进而促进花芽内休眠的解除[43]。张玉喜等[44]发现在鲁荷红休眠解除过程中PsGA20ox基因表达水平与内源GA3含量呈显著正相关，低温累积可诱导PsGA20ox基因的表达，调节内源赤霉素含量促进花芽休眠解除。

2.3牡丹芽休眠的解除途径

2.3.1低温

根据牡丹芽休眠的特性，低温对解除牡丹深休眠具有质的作用，是解除牡丹深休眠的根本措施。不同的低温时数对牡丹花芽的发育状况有着质的影响[35]。打破牡丹花芽休眠的最适条件为0℃处理14d以上，此外0～10℃的自然低温也是打破牡丹花芽休眠的有效措施[45,46]。自然低温比恒定低温更为有效的解除花芽休眠，所需时间更少，但是成花率不如恒定低温[47]。张文娟[48]认为4℃低温处理较自然低温更能有效的提前花期，但会降低花枝质量；不同牡丹品种解除休眠所需的低温不同；在一定范围内，适当降低处理温度，可相应缩短低温时数。同种或者同株不同器官需要的低温处理条件也不相同，比如0℃处理8d能解除花原基的休眠但不能彻底解除叶原基的休眠，叶原基则需0℃低温处理15d以上才能彻底解除休眠[49]。

2.3.2外源激素

外源激素对解除牡丹芽休眠具有一定的辅助作用。牡丹催花实践中，GA3的应用最为广泛。对休眠程度深、低温作用不完全的花芽，以500～1000mg·L-1的GA3处理3～4次，解除花芽休眠的有效率在90%以上[50]。当低温需求量不足时，结合赤霉素处理能有效的解除牡丹花芽休眠，提高植株萌发整齐度和成花率，并且减少积温促进开花[41,47,51]。生产上人们还会采用使牡丹经历一段时间的自然低温后再用赤霉素进行抹芽、整株喷施、裸根喷施解除其休眠的方法，植株虽提前萌发，但花蕾败育率高，成花率低、花器官发育畸形，且叶易徒长[30]。张文娟[48]认为花芽分化基本完成的植株用适当浓度的赤霉素处理后，遇到合适的温度条件就能萌发、生长，但这些植株后期容易发生败育，与赵海军等[30]研究结果相同。

2.3.3其它化学物质

其它诸如用氰氨化钙、乙醛蒸气、乙烯、氮气和大蒜糊剂等化学物质等也可辅助低温打破休眠，例如用大蒜糊剂涂抹牡丹花芽，这些物质均可促进牡丹花芽萌发和叶伸展，提前开花，但这种促进作用随着低温天数在一定范围内的增加而逐渐减弱[52]。

3、牡丹组培苗休眠的研究进展

牡丹组织培养经过了近半个世纪的发展，目前已经在牡丹外植体的选择及取材时间、基本培养基筛选、激素调节、环境因子调控等方面均取得了不同程度的进展[3,53]。尤其在生根诱导方面，取得了很大的突破，有些品种的生根率可达70%～80%[54,55]。然而试管苗移栽成活率低至今未能取得进展，严重制约其规模化生产，其主要原因是试管苗存在顶芽休眠现象。牡丹组培苗生根阶段产生了顶芽休眠，未解除休眠的试管苗移栽后不生长，并逐渐死亡[6],且这种休眠不能用低温来打破[56]。目前对于牡丹组培苗顶芽休眠的研究较少，关于牡丹生根诱导阶段顶芽休眠的原因未有定论。

4、展望

牡丹休眠的研究在牡丹种子和芽休眠的原因、机理以及解除休眠的方法等方面都取得了较大的进展，但牡丹种子休眠的相关分子机理尚未明晰，牡丹芽休眠的相关基因虽然已经找到，但基因的功能以及作用机理尚未得到验证；牡丹组培苗的休眠研究尚未有进展。后期需要围绕以下几个问题展开重点研究。

1)种子休眠分子机理：

牡丹种子休眠具有严格的上胚轴和下胚轴休眠，以往的研究主要集中在种子休眠的原因以及打破方法上，对于牡丹种子休眠的分子机理研究的尚不透彻，建议后期在研究打破牡丹种子休眠方法的同时，进一步研究休眠发生的分子机理，为打破休眠的方法提供理论参考。

2)芽休眠相关基因验证：

在芽休眠的分子机理的研究中，已经分离出与牡丹芽休眠的相关基因，如PsPⅡ、PsSERK2、PsGA20ox等，但这些基因是如何作用来调控牡丹芽的休眠进程，以及休眠的关键基因的功能尚未得到验证，建议后期的研究重点宜关注休眠基因的调控机理，为牡丹反季节栽培提供理论支持和技术支撑。

3)组培苗休眠研究：

目前关于牡丹组培苗的研究主要集中在生根和移栽上，牡丹组培苗顶芽休眠是抑制移栽成活的主要因素，建议后期着力于研究顶芽休眠的机理以及如何打破顶芽休眠，为牡丹组培苗工厂化生产提供理论支持和技术支撑。

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