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MiR-106b-5p调控老年骨质疏松性骨折的分子网络

2021-12-02 118 上传者：管理员

摘要：背景:骨质疏松性骨折是与年龄有关的疾病,由于人口老龄化,其发病率和患病率不断上升。目的:鉴定miRNA与老年骨质疏松性骨折有关。方法:通过limma包分析GSE93883中骨质疏松性骨折相关的差异表达miRNA;通过RAID数据库预测差异表达miRNA的靶标基因,并通过PPI(蛋白质-蛋白质相互作用)网络识别关键miRNA及靶标基因;富集分析识别靶标基因参与的生物功能和信号通路。最后,收集5例老年骨质疏松性骨折和5例老年非骨质疏松性骨折患者的骨组织,利用qPCR和Westernblot验证关键miRNA及信号通路。结果与结论:(1)共获得21个骨质疏松性骨折相关的差异表达miRNA并预测得到530个靶标基因;通过PPI网络鉴定miR-106b-5p为关键调控基因,其靶标基因主要与MAPK活性的激活等生物功能以及PI3K-Akt和转化生长因子β信号通路相关;(2)qPCR结果验证了miR-106b-5p在老年骨质疏松性骨折骨组织中的表达较对照骨组织显著下调(P<0.05);Westernblot结果显示PI3K-Akt和转化生长因子β信号通路在老年骨质疏松性骨折中被激活;(3)提示:miRNA参与老年骨质疏松性骨折,并与PI3K-Akt和转化生长因子β信号通路相关。miR-106b-5p可能抑制骨质疏松性骨折的发生,并成为潜在的标志物和治疗靶标。

关键词：
miR-106b-5p
PI3K-Akt
差异表达
转化生长因子β
骨质疏松性骨折
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骨质疏松症是临床最常见的骨骼疾病之一，它可以在任何年龄发生。骨质疏松症的主要特点是骨量和质量的下降，使患者容易发生骨质疏松性骨折(脆性骨折)，造成创伤[1]。骨质疏松症在老龄人口中普遍存在，并已成为世界范围内健康威胁的主要因素之一。随着社会经济的快速改善，人类预期寿命的延长和出生率的降低，中国人口在过去几十年中已大幅老龄化，导致骨质疏松等与老龄化有关的慢性病的发病率随之上升[2]。据报道，2010年，全世界约有2100万男性和1.37亿女性在50岁及以上时处于骨质疏松性骨折的高风险期[3]。在中国，超过1/3的女性和大约1/10的男性患有严重的骨质疏松性骨折[4]。有研究表明，骨质疏松性骨折与后续发生骨折的高风险和高死亡率密切相关[5]。此外，骨质疏松性骨折对患者和医疗系统造成很大的经济压力[6,7]。因此，预防和治疗骨质疏松性骨折尤为重要。

在目前正在开发的几种新技术中，使用microRNAs(miRNAs)作为骨质疏松性骨折的生物标志物是很有吸引力的。miRNAs是一种小的内源性调节RNA，通过充当调控基因表达的表观遗传关键因素，影响许多生理和病理生理过程[8]。尽管miRNAs并不完全互补于mRNA序列，miRNAs与具有相似序列的目标基因相互作用，抑制了不同基因的翻译。许多研究报道，miRNA通过其在成骨细胞和破骨发生中的活性来调节骨的发育和稳态[9]。有趣的是，miRNAs也参与了骨重塑和骨质疏松等许多骨代谢疾病的过程。miRNA在骨质疏松症和难治性骨质疏松性骨缺损方面显示出前所未有的诊断和治疗潜力[10,11]。目前，已有大量研究证实了骨质疏松性骨折中miRNAs与骨折及愈合受损相关[12,13]。鉴于这些结果，miRNAs或许可以作为诊断骨质疏松性骨折的生物标志物，也可以作为治疗骨质疏松性骨折患者骨丢失的靶点。

越来越多的miRNA阵列数据被上传并存储在基因表达总括(GEO)数据库中。利用GEO数据库，一些研究通过高通量miRNA阵列分析miRNA的表达特征，以进行生物标志物鉴定。这项研究通过GSE93883明确骨质疏松性骨折和miRNA之间的联系，并收集老年骨质疏松性骨折的临床样本进行验证，以了解骨质疏松性骨折的特征性miRNA及其调控网络机制，为鉴定老年骨质疏松性骨折的生物标志物和治疗靶标奠定理论基础。

1、资料和方法

1.1 分子网络学分析

1.1.1 数据收集及差异分析

收集GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)的GSE93883数据集，其中包含6例骨质疏松性骨折样本、6例骨质疏松非骨折样本、6例非骨质疏松非骨折样本的miRNA表达谱。通过limmaR软件包计算骨质疏松性骨折与对照样本，以及骨质疏松非骨折与对照样本之间的差异表达miRNA(DEM)。P<0.05且|log2foldchange(FC)|≥2筛选显著差异表达的miRNA。此外，利用RAID数据库(http://www.rna-society.org/raid)设置筛选得分大于0.7，预测miRNA的靶标基因。

1.1.2 PPI网络分析和富集分析

根据String数据库(http://string-db.org/)中蛋白质相互作用信息，构建靶标基因的PPI网络，并进行连接度(degree)排序。利用clusterProfilerR软件包进行基因本体论(geneontology,GO)与京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)途径分析。设置筛选阈值P<0.05。

1.2 核心miRNA和信号通路的验证

1.2.1 时间及地点

实验于2020年5月至6月在新疆医科大学第七附属医院骨科实验室完成。

1.2.2 样本收集

5例老年骨质疏松性骨折和5例老年非骨质疏松性骨折患者的骨组织收集自新疆医科大学第七附属医院。T值[(骨密度-骨峰值)/标准差]<-2.5的老年骨折为老年骨质疏松性骨折的纳入标准。纳入研究的非骨质疏松性骨折患者为T值>-2.5且由创伤所致骨折。这项研究得到了新疆医科大学伦理委员会的批准。所有患者均充分了解这项研究，并签署了书面同意书。

1.2.3 实时定量PCR

利用Trizol提取200μg液氮研磨的骨组织中的总RNA。随后，通过miScriptⅡRTKit(Qiagen)将RNA反转录成互补DNA(cDNA)。最后，用miScriptSYBRGreenPCRKit检测miR-106b-5p的表达。U6为内参基因，基因表达结果以2-ΔΔCt方法计算。引物序列为：miR-106b-5p(F:5‘-TGCGGCAACACCAGTCGATGG-3’,R:5‘-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’);U6(F:5‘-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,R:5‘-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)。

1.2.4 Westernblot

采用Westernblot方法检测骨组织样本中Akt和转化生长因子β(transforminggrowthfactor-beta,TGF-β)蛋白的表达水平。从骨组织中提取总蛋白，用Bio-Rad进行定量分析。然后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，并转印到PVDF膜上。分别与Akt(Abcam)和TGF-β(Abcam)抗体在37℃下孵育过夜后，用辣根过氧化物酶结合二抗(Abcam)在37℃孵育1h。以GAPDH为内参对照。最后，利用凝胶成像系统(Bio-Rad)对蛋白质表达进行评价。

1.2.5 主要观察指标

骨组织中miR-106b-5p含量，以及TGF-β和AKT蛋白表达水平。

1.2.6 统计学分析

在SPSS22.0中进行统计学分析，结果以柱形图形式给出，用表示。学生t检验用于两组之间的比较，双边α=0.05。采用LassoCox比例风险回归分析确定骨质疏松性骨折的独立危险因素。P<0.05认为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 分子网络学分析

2.1.1 骨质疏松性骨折的差异表达miRNAs

为了确定在骨质疏松性骨折中差异表达的miRNAs，获得了骨质疏松性骨折、骨质疏松性非骨折和对照样本的miRNA表达谱，见图1A。以P<0.05且|log2FC|≥2为标准，骨质疏松性骨折和对照之间获得了37个差异表达的miRNAs，见图1B；骨质疏松性非骨折和对照之间获得了51个差异表达的miRNAs，见图1C。在这些差异表达miRNAs中，鉴定出21个miRNAs为骨质疏松性骨折相关的miRNAs，见图1D。

2.1.2 DEM及靶基因的筛选与鉴定

利用RAID数据库预测21个miRNAs的调控靶标基因，共得到了530个骨质疏松性骨折相关miRNA的靶标基因。通过构建靶标基因的PPI网络，鉴定出连接度(degree)最高的前10个靶标基因，见图2A，并进一步识别了10个靶标基因所对应的DEM，见图2B。其中，miR-106b-5p调控最多的靶标基因(CCND1,MAPK1,STAT3,VEGFA和MYC)而被筛选为核心miRNA。与对照组相比较，miR-106b-5p在骨质疏松性骨折中差异表达下调(P<0.01)，见图2C。

2.1.3 miRNAs靶基因的GO和KEGG途径

GO功能注释分析结果表明，骨质疏松性骨折相关miRNAs的靶标基因主要参与凋亡进程，MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)活性的激活等生物进程，见图3A。

KEGG通路分析表明，靶标基因主要富集的途径是“PI3K-Akt(磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B)信号通路”“MAPK信号通路”等，见图3B。

另外，对miR-106b-5p的信号通路网络研究结果表明，其与TGF-β(转化生长因子β)信号通路和PI3K-AKT信号通路密切相关，见图3C。

2.2 核心miRNA和信号通路的验证结果

通过qPCR实验，验证了miR-106b-5p在老年骨质疏松性骨折与对照的骨组织相比差异表达显著下调(P<0.05)，见图4A。Westernblot实验结果显示，老年骨质疏松性骨折的骨组织中TGF-β信号通路和PI3K-AKT信号通路被激活，见图4B。

3、讨论

身体正常的骨形成和功能依赖于动态平衡过程，在动态平衡过程中，成骨细胞诱导成骨，而破骨细胞诱导骨吸收。因此，由于骨质疏松症等因素打破骨形成的动态平衡，一般倾向于骨量丢失，削弱骨强度，相应地诱发骨质疏松性骨折[14]。目前，人们已经做了大量的工作来识别和验证miRNAs作为骨折风险的循环生物标记物[15,16]。此次研究发现骨质疏松性骨折和对照组织之间的37个差异表达miRNA中，有21个与骨折相关。其中，在骨质疏松性骨折中下调的hsa-miR-106b-5p被鉴定为核心miRNA。研究报道miR-106b-5p在绝经后妇女椎体骨折中差异表达[17]。据报道，miR-106-5p与血清17β-雌二醇显著相关，并被预测为血管内皮生长因子和Smad6/7的上游调节因子[18]。在FK506促进成骨分化和骨形成的过程中，miR-106b-5p显著差异上调表达，参与干细胞分化、TGF-β受体信号转导[19]。miR-106b-5p通过靶向RANKL和其他细胞因子(白细胞介素8、基质金属蛋白酶2和TWIST)，被证实是一种新的破骨和骨溶解抑制剂[20]。还有研究显示，miR-106b-5p通过靶向Smad5抑制成骨细胞分化[21]。因此，作者认为miR-106b-5p可以作为骨质疏松性骨折的潜在保护性治疗靶标。

miR-106b-5p的靶标基因中，细胞周期调节蛋白D1(CyclinD1,CCND1)与绝经后骨质疏松有关，在破骨细胞中参与Wnt/β-catenin信号[22]。CCND1通过促进细胞增殖，调节细胞周期从G1期向S期的转变[23]。骨髓间充质干细胞在维持骨质疏松相关的骨内动态平衡的微环境中具有重要作用[24]。已有研究发现下调表达的CCND1可导致人骨髓间充质干细胞向成脂而非成骨方向分化[25]。骨细胞通过细胞骨架适应和MAPK通路在骨折中发挥抗炎作用[1]。MAPK1是活性氧、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路中的常见基因，MAPK磷酸化后通过相关转录因子的分化来促进脂肪形成和成骨，是间充质干细胞分化过程中唯一的活跃信号[26]。MAPK的激活在破骨发生中也起着关键作用[27]。

人类和小鼠信号转导与转录激活子3(signaltransducersandactivatorsoftranscription-3,STAT3)的缺乏与骨异常和破骨细胞数量增加有关，其发挥抗炎作用，是抑制破骨作用的一个重要分子途径[28]。造血细胞特异性STAT3缺陷小鼠通过增加破骨作用而发生骨质疏松，导致骨小梁和皮质骨的减少[29]。研究显示，通过STAT途径发出信号对成骨细胞的分化是很重要的[30]。此外，早期成骨细胞系细胞的血管内皮生长因子A(vascularendothelialgrowthfactorA,VEGFA)是骨折愈合所必需的[31]。VEGFA由于对促进血管生成有很强的亲和力，而骨修复的过程需要血管生成[32]。这在其他研究中得到了证实，组成型Osx-Cre小鼠中的VEGFA缺失在长骨发育和修复期间损害成骨细胞生成[33,34]。成骨细胞中MYC(c-Myc)的减少具有抑制破骨作用[35]。MYC或许可以作为调控成骨细胞和破骨细胞分化的靶标[36]。

为进一步探讨骨质疏松性骨折中miRNA的调控分子机制，对靶标基因进行了功能富集分析。MAPK信号通路是与骨折相关的miRNA靶基因的富集结果，MAPK信号的持续抑制促进细胞外基质的早期成骨分化和矿化[37]。TGF-β激活MAPK通路，抑制间充质多能细胞和成骨前细胞的成骨作用[38]。在一些研究中，TGF-β3被认为是骨质疏松严重程度的一个指标。TGF-β在骨质疏松症中对骨形成和吸收具有双重作用[3,39]。有研究表明，血清TGF-β3水平与骨密度T评分呈显著正相关，与骨质疏松性骨折的发生呈负相关[40]。TGF-β和VEGF在骨折中迅速位于骨折部位，促进血管形成，同时从外周血中吸收各种类型的干细胞，诱导其分化为成骨细胞，加速骨折修复[41]。PI3K-Akt途径的活化参与人骨质疏松过程中，促进成骨分化并保护成骨损伤[42,43]。

miRNAs在多种生物功能中的关键调节作用是一个成熟的概念，其与多种生理和病理条件的关系也在推动其作为生物标志物的临床应用。此次研究结果提示miR-106b-5p可以作为老年骨质疏松性骨折的生物标志物和治疗靶标而进行深入研究。miR-106b-5p可能通过TGF-β和PI3K-Akt途径调节骨质疏松性骨折的进展。

此次研究的局限性在于分析的基因表达谱收集自公共数据库，样本数量相对较小。为了解决这一问题，需要进一步收集临床样本进行实验验证重要的分析结果。尽管如此，miR-106b-5p对老年骨质疏松性骨折的预测作用仍需要大量临床样本进行验证。

文章来源：王海龙,李龙,伊力哈木·托合提,刘旭,那次克道尔吉,陈洪涛,崔泳.MiR-106b-5p调控老年骨质疏松性骨折的分子网络[J].中国组织工程研究,2022,26(02):239-244.