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DNA甲基化在骨质疏松症中的研究进展

  2022-01-15    67  上传者:管理员

摘要:骨质疏松症是以骨微结构退化、强度下降为主要变化的骨骼疾病,常导致骨折的发生。它通常是由骨吸收增加,而骨形成的相应增加不能充分代偿所引起的。骨质疏松症常常由多因素引起,其中遗传因素对于峰值骨量、骨结构以及骨骼恶化和脆性骨折的易感性至关重要。然而,仅遗传因素不足以解释骨质疏松症的发生发展以及脆性骨折的发生。目前表观遗传因素被认为与骨质疏松症密切相关,且已证实骨代谢受表观遗传机制的调控。作为表观遗传学重要组成的DNA甲基化,可通过调控骨质疏松相关基因的表达影响骨质疏松症的发生发展。本文综述了DNA甲基化对成骨细胞、破骨细胞、间充质干细胞的作用机制,探讨将DNA甲基化作为骨质疏松症诊治生物标志物的意义和可能性。

  • 关键词:
  • DNA甲基化
  • 成骨细胞
  • 破骨细胞
  • 间充质干细胞
  • 骨质疏松症
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骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种以骨量减少、骨脆性增加为特征的全身性代谢性骨骼疾病,常常导致脆性骨折的发生。而OP的发生多由基因和环境因素、饮食习惯、生活方式之间相互作用而引起骨骼重塑失调所致。骨形成与吸收的平衡和维持骨重塑中骨稳态密切相关[1]。在成人骨骼中,骨形成与吸收主要依赖于间充质成骨细胞系和造血破骨细胞系两者的相互作用、分化及其相应的功能。由于成骨细胞(osteoblast, OB)和破骨细胞(osteoclast, OC)的分化、活化和凋亡受到高度调控,能够使骨重塑保持平衡。一旦调控过程出现异常,往往导致骨稳态失衡。目前,有全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)表明在人类OP和骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture, OPF)发生发展过程中存在遗传变异和DNA甲基化改变[2]。此外,Kemp等[3]通过GWAS分析确定了多个与骨密度(bone mineral density, BMD)相关的基因位点,然而这些位点只能解释部分骨表型变异(约12%)。

表观遗传学是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,主要包括转录后microRNA(miRNA)介导的靶mRNA负调控、DNA甲基化以及组蛋白修饰。DNA甲基化修饰具有高度动态、可逆、年龄相关、细胞和组织特异性的特征,并且对内源性信号和(或)环境刺激敏感。目前,DNA甲基化被认为是通过环境因素和随机内外源性应激促进OP发生发展的关键机制之一。DNA甲基化加强了个体基因组与环境之间的联系,它能够影响骨表型和患OP的风险,并与遗传基因变异协同作用,在一定程度上可以解释为什么仅靠遗传因素不足以解释OP发生发展和脆性骨折易感性的原因。DNA甲基化主要通过对OB、OC、间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的调节引起骨重塑失调,从而促进OP的发生发展。

本文通过综述DNA甲基化对OB、OC以及MSCs的作用机制,探讨将DNA甲基化作为OP诊治及预后生物标志物的意义和可能性。


1、DNA甲基化在骨稳态中的影响


DNA甲基化是指在基因组CpG岛上胞嘧啶残基的第5个碳上加上一个甲基的可逆共价加成,通常与基因表达抑制有关。DNA甲基化在调节生物过程和响应外界环境信号中发挥着重要作用。越来越多的研究证明环境因素包括行为、营养、化学物质以及工业污染物等具有表观遗传效应。除了遗传因素外,人的整体健康状况被认为是多种环境信号的整合,这些信号从妊娠开始并通过表观遗传修饰如DNA甲基化发挥作用[4]。一项全基因组研究评估了骨质疏松性髋关节骨折患者股骨头骨小梁样本的DNA甲基化图谱(分析了13463个基因中23367个GpG位点的甲基化),结果表明,甲基化与全基因表达之间存在负相关关系[5]。DNA甲基化状态共同调节与骨相关细胞功能有关的各种重要基因表达,如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、硬化蛋白(sclerostin, SOST)、雌激素受体α(estrogen receptor alpha, ERα)、核因子kB受体活化因子配体(receptor activator of NF-kB ligand, RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin, OPG)等[6]。其中RANKL/OPG被认为是调节骨吸收的关键因素[7]。

DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)介导DNA甲基化,催化DNA序列CpG岛甲基化,降低基因组稳定性以抑制转录活性。DNMT由DNMT1、DNMT3A、DNMT3B组成[8]。DNMT1能够维持半甲基化DNA的甲基化状态,DNMT3A和DNMT3B则优先作用于未甲基化和半甲基化的DNA;而TET蛋白(ten-eleven translocation, TET)能够转化5-甲基胞嘧啶为5-羟甲基胞嘧啶以诱发DNA脱甲基反应[9]。有研究发现DNMT可参与调控骨形成与骨吸收[10,11]。TET1和TET2用以维持MSCs细胞稳态和骨稳态,TET1和TET2缺失会导致MSCs成骨分化过程缺陷甚至严重骨质疏松[12]。

DNA甲基化能够改变个体的表观遗传组成并产生稳定的表观遗传效应。通常DNA甲基化通过维持稳定的浓缩染色质构型来建立基因表达抑制状态[13]。Laurent等[14]研究表明DNA甲基化在DNA复制和有丝分裂过程中得以保留,因此基因组的抑制状态可以遗传至子代。这一发现表明,母体DNA甲基化改变对骨稳态的影响可能遗传至子代。

因此,更好地理解DNA甲基化对骨稳态的影响,并阐明可能的表观遗传机制,这将有助于降低老年人骨质疏松和脆性骨折的风险。

1.1 DNA甲基化对成骨细胞的影响

SOST基因的甲基化与绝经后妇女的OPF发生密切相关[15]。SOST基因编码硬化蛋白,硬化蛋白主要在骨细胞中表达,是一种重要的骨调节剂[16]。硬化蛋白能够抑制OB活性,同时刺激OC来抑制骨形成[17]。Reppe等[15]实验表明,硬化蛋白作为Wnt/β-catenin信号调节剂通常在成骨时发挥关键作用。在OP患者中,SOST启动子甲基化增加被认为是一种代偿性抵消机制,该机制降低血清硬化蛋白浓度并减轻对Wnt信号传导的抑制,从而促进骨骼的形成。时宇博等[18]研究结果显示,绝经后OP患者血浆SOST mRNA相对表达量明显高于无OP者。与无OP者血浆SOST基因甲基化状态相比,绝经后OP患者血浆中SOST基因甲基化阳性率低,提示SOST基因甲基化可抑制其mRNA表达。Cao等[19]研究证明OPF患者骨组织中SOST mRNA表达水平与SOST基因甲基化阳性率呈负相关。Delgado-Calle等[20]观察到,在人股骨骨细胞中,SOST近端启动子区域呈低甲基化,而在原代OB和骨内膜细胞中则无甲基化,这表明不同细胞类型之间SOST的差异性表达至少部分受到DNA甲基化的调节。因此,SOST基因甲基化可通过阻碍转录因子与启动子的结合影响mRNA表达,降低转录水平,这可能是OP发生的机制之一。

众所周知,雌激素缺乏易导致OP。雌激素通过与ERα结合激活ERα相关信号通路发挥作用。有研究发现SOST启动子甲基化的改变可影响雌激素与ERα的结合[21]。此外,雌激素能够通过DNA甲基化增强ERα基因表达,这在一定程度上也影响了雌激素的生物学功能[22]。

骨细胞中的ERα通过调节Wnt拮抗剂表达而在小梁骨形成中起骨保护作用[23]。单独敲除小鼠OC中的ERα时,小鼠则出现骨小梁区骨量的显著降低、骨转换率升高以及OC数量的增多[22]。Rooney等[24]研究集中于特定骨细胞及其前体中靶向缺失ERα的小鼠。成骨祖细胞及前体细胞中缺乏ERα,通常会影响小鼠的骨膜。小鼠分化的OB、OC中缺失ERα,通常会导致骨松质骨量减少,而雌性小鼠通常出现更严重的骨量缺陷,提示ERα对骨具有保护作用。此外,Lv等[25]研究证明ERα基因启动子a区甲基化导致雌激素受体mRNA减少,相比绝经前妇女,绝经后妇女中启动子甲基化水平增加。Penolazzi等[26]研究人OB中ERα基因远端启动子F的甲基化状态,发现其与OB的生长、分化、活性有密切关系,且ERα基因启动子F内部CpG位点的甲基化可能直接或间接有助于ERα基因的转录控制,从而影响该基因的组织特异性表达。由此可知,DNA甲基化对雌激素及ERα在OP的影响是多途径的。

1.2 DNA甲基化对破骨细胞的影响

核因子kB受体活化因子(receptor activator of NF-kB,RANK)是OC表面的受体,由骨髓基质细胞、OB两者合成分泌的RANKL和OPG为RANK的配体,两者结合可刺激OC分化,促进骨吸收,而OPG与RANK的结合阻断这种活性[27,28,29]。OPG/RANKL/RANK作为介导OB与OC相互作用的信号通道,可调控OC的成熟、分化、活性,是最重要的骨代谢信号调节系统之一[30]。因此,该系统的甲基化调节可能在原发性OP发生中起到重要作用[31]。

OC的分化被认为需要RANKL与巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)信号传导[32]。小鼠ST2细胞去甲基化处理后,RANKL表达显著增加,说明RANKL启动子的甲基化水平与其表达水平相关。在高同型半胱氨酸血症伴OP动物模型中,DNMT1表达增强,使OPG启动子被高甲基化,OPG转录被抑制,从而激活RANKL表达和OC形成,导致骨丢失[33]。Wang等[7]研究证明RANKL和OPG启动子中CpG位点甲基化水平能够影响其表达,并且发现与非骨质疏松性骨折的骨组织组相比,RANKL启动子CpG岛中32个CpG位点在OPF组中高度去甲基化。OPG基因启动子在OPF组与非OPF组均被低水平甲基化,但是OPF组中的甲基化水平高得多。这些结果表明,DNA甲基化通过抑制RANKL和OPG表达从而影响OPG-RANKL系统失衡,导致骨质疏松的发生。

DNMT3A介导DNA甲基化,参与OC的生成、分化成熟。Nishikawa等[34]研究证明,DNMT3A通过S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionin, SAM)介导DNA甲基化,抑制干扰素调节因子8(interferon regulatory factor 8,IRF8)以调控OC生成,IRF8是OC表型的关键负调控因子,需要在表观遗传上沉默才能使OC生成。DNMT3A敲除小鼠OC前体不能在体外有效地分化成熟,DNMT3A敲除小鼠模型与正常对照组相比,活性OC数量减少,骨量增加,然而给去卵巢的雌性小鼠(作为绝经后OP的模型)注射DNMT3A抑制剂Theaflavin-3,30-Digallate(TF-3),发现活化OC数量减少,骨量增加,有利于防止骨丢失,提示抑制DNMT3A可能是预防骨丢失和控制绝经后OP的有益策略[10]。因此需要进行以OC活性过高为特征的OP和其他骨骼疾病的临床试验,进一步证实该结果,为探索OP新的治疗方法带来希望。

1.3 DNA甲基化对MSCs的影响

MSCs向OB分化的过程同样也受DNA甲基化的调节。Cao等[35]进行了MSCs非诱导成骨分化和MSCs诱导成骨分化之间DNA甲基化水平的全基因组研究,发现在诱导MSCs组中CpG的大多数胞嘧啶被甲基化。Marofi等[36]发现ZBTB16和Twist1基因的启动子区域中的DNA甲基化可能是控制MSCs向OB分化的主要机制之一。

Nomura等[37]研究发现DNMT3A和DNMT3B活性在MSCs软骨分化过程中显著上调,DNMT3A过表达显著增强了MSCs软骨分化能力。此外,Cakouros等[38]发现TET在MSCs分化中起关键作用。TET1可以抑制MSCs成骨和成脂分化,并且可能通过募集其他表观遗传修饰剂以间接发挥作用,而TET2则直接促进MSCs成骨和成脂分化。同样地,在OP患者中TET1和TET2转录水平均被下调。靶向TET分子或其下游靶标可能提供新的治疗策略,以帮助防止骨丢失和创伤或疾病后的修复。

脂肪细胞和OB皆源自MSCs的中胚层谱系。Cho等[39]证明了DNA甲基化抑制剂5-氮杂2'-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-dC)在脂肪形成和OB发生之间具有谱系确定作用。Wnt10a是决定间充质谱系走向OB的关键因素。Wnt10a 5'-区域富含CpG位点,5-Aza-dC能够显著降低其甲基化水平,上调Wnt10a基因表达,提示5-Aza-dC可通过抑制3T3-L1脂肪前体细胞中的DNA甲基化而显著抑制脂肪生成,并促进OB生成。因此,DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC的应用可能为伴有肥胖症的OP患者的治疗提供新途径。


2、DNA甲基化研究对骨质疏松症预防、诊断、治疗的意义


2018年中国首个OP流行病学调查发布,结果显示我国50岁以上人群的OP患病率为19.2%,50岁以上女性的OP患病率高达32.1%,65岁以上女性的OP患病率更是达到了51.6%。我国低骨量人群数量大,在不良生活习惯与年龄增加等多因素影响下,其患OP的风险进一步加重,且普遍对OP认知不足,骨密度检测率低,预防意识不强。因此,如何有效、科学地防治OP是当前亟待解决的公共健康问题。但目前在治疗过程中尚没有合适的指标可以预示患者的新发骨折风险,同时也缺乏合适指标用于治疗早期监测药物疗效与指导临床医师治疗方案的选择[40]。

在细胞分化过程中,DNA甲基化是动态的,但某些DNA甲基化模式可能会以表观遗传记忆的形式保留,且DNA甲基化能够产生稳定的表观遗传效应[41]。尽管存在外部干扰,但由于甲基化的高稳定性以及稳定表观遗传效应,它们仍可以在众多生物样品中作为指导诊断、预后、治疗的生物标志物。然而,目前仍无甲基化测试应用于临床OP筛检治疗,且外周血DNA甲基化模式是否可以作为OP生物标记的研究较少且研究结果不一致[42]。因此,目前外周血DNA甲基化标记用于OP患者的筛检和疗效的监测是否可行仍然存疑。

Fernandez-Rebollo等[43]比较分析了16名非OP患者与32例原发性OP患者的外周血全基因组DNA甲基化谱,但未在OP患者中发现任何一个CpG位点存在显著异常甲基化。同上述结论相反,Reppe等[44]研究测试了患OP和健康的绝经后妇女骨骼和血液中的DNA甲基化分布,在对应100个表达水平与BMD最显著相关基因的2 529个CpG位点中,有63个CpG位点的甲基化水平在患OP女性和健康女性之间存在统计学上的不同,其中有53个CpG位点患OP妇女的甲基化水平高于健康妇女。绝经后妇女中间组结果(其BMD水平和临床特征介于患OP女性和健康妇女之间的中间水平)也证实了63个CpG位点中的84%为中间DNA甲基化水平。随后测试了来自独立队列血细胞中选定的骨CpG的甲基化水平。此分析局限于450名68岁及以上献血者中的250名白人妇女。总共选择了63个CpG甲基化位点进行测试。有趣的是,在独立的队列中,血液中的63个CpG中有13个也显示与BMD相关。当比较高骨密度和低骨密度时,其中的12种CpG(除UGP2中的cg12876517以外)沿着与骨骼相同的方向改变,因此表明骨骼和血液中的DNA甲基化调节机制相似[44]。Cheishvili等[45]检测了22名正常女性和22名绝经后OP女性(51~89岁)的外周血全基因组DNA甲基化谱,在对比分析得出的1 233个差异甲基化的CpG位点列表中进一步进行热图和聚类分析,最终发现差异最显著的77个CpG位点的差异甲基化可有效区分非OP者与OP患者,提示这些位点与OP有关。在早期OP患者中也发现了这些差异位点,因此这些位点也可作为OP早期外周血生物标记。

表观遗传修饰剂可缓解OP的发展,如DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC可改善废用性OP发展[46]。但目前表观遗传修饰剂用于OP治疗仍然难以实现。因此,表观遗传修饰剂临床实验研究的开展对OP的治疗具有重大意义。例如开展在外周血DNA甲基化模式的大规模研究可进一步帮助确定外周血DNA甲基化标记与OP的相关性,使外周血DNA甲基化标记用于OP患者的筛检和疗效的监测成为可能。


3、总结


DNA甲基化在骨代谢和OP等年龄相关性疾病中具有重要作用且通常与基因表达的抑制有关。DNA甲基化影响OB的分化和MSCs成骨分化谱系确定,并在OC的分化、成熟以及OC和OB间平衡的调控中发挥作用。尽管存在外部干扰,但由于甲基化具有很高的稳定性,它们仍具有在众多生物样品中用作指导诊断、预后、治疗的生物标志物的潜力。但目前仍无OP针对性的甲基化测试,外周血DNA甲基化标记用于OP患者的筛检和疗效的监测是否可行仍然存疑。因此致力于寻找外周血中OP相关甲基化生物标记及外周血DNA甲基化模式作为OP生物标记可行性验证的研究,对早期OP患者的发现诊断、指导治疗方案的选择以及个体化精准治疗OP具有重大的意义。


参考文献:

[1]时宇博,朱福良,李立军,等.绝经后骨质疏松症患者血浆SOST表达变化及其与基因甲基化的关系[J].山东医药,2016,56(16):35-37.

[2]徐绍俊,黄建烽,邵敏,等:雌激素受体a基因甲基化与骨质疏松关系的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2017,23(3).388-391.

[3]汪纯.原发性骨质疏松症发病及诊治的现状和展望[J].诊断学理论与实践,2020,19(3).209-213.

[4]牛亚丹,林伊荷,张汉清,等.DNA甲基化与骨代谢调节及骨质疏松症研究进展[J].生命科学,2020,32(2):162-169.


文章来源:潘晓豪,周展毅,凌奕清,厉驹,徐涛涛.DNA甲基化在骨质疏松症中的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(01):114-119.

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