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HIF-1α激动剂或拮抗剂对脓毒症大鼠肠道黏膜通透性的影响

2021-11-10 72 上传者：管理员

摘要：目的探讨脓毒症(sepsis)和HIF-1α激动或拮抗剂对肠道黏膜屏障(IMB)功能的影响。方法将SD大鼠随机分假手术组(sham)、sepsis组[sepsis,用盲肠结扎穿孔(CLP)建立sepsis模型]、(sepsis+HIF-1α激动剂)/(sepsis+DMOG)组[CLP术前连续7d腹腔注射HIF-1α激动剂DMOG(40mg/kg)]、(sepsis+HIF-1α拮抗剂)/(sepsis+BAY87-2243)组,[CLP术前连续3d口服灌胃HIF-1α抑制剂BAY87-2243(9mg/kg)],各6只。ELISA检测大鼠血浆肠黏膜通透性标志物二胺氧化酶(DAO)、肠型脂肪酸结合蛋白2(FABP2)、D-乳酸和荧光素标记的右旋糖苷(FD4);HE染色检测大鼠肠黏膜形态学改变;Westernblot检测大鼠肠黏膜缺氧诱导因子-1(HIF-1α)以及紧密连接(TJs)蛋白表达。结果Sepsis致大鼠肠黏膜病理形态学破坏、通透性增加(P<0.05)、HFI-1α表达上调、TJs表达下调(P<0.05);加入DMOG能减轻肠黏膜病理损伤、降低肠黏膜通透性(P<0.05);而大鼠经过BAY87-2243处理得出相反的结果。结论HIF-1α激动剂能明显降低sepsis大鼠肠道黏膜通透性,其抑制剂作用相反。表明脓毒性肠黏膜损伤,HIF-1α上调可能对肠黏膜具有保护作用。

关键词：
BAY87-2243
DMOG
低氧诱导因子1α
肠道黏膜通透性
脓毒症
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脓毒症(sepsis)是机体对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[1],是一个公认的全球健康问题，严重威胁人类生命安全。2017年全球统计数据显示[2],sepsis年发病例4890万例，死亡病例约110万例，死亡率为19.7%;拯救sepsis运动指南为临床管理sepsis患者提供一些列循证医学建议，在sepsis发病机制方面仍然存在很多认识空白[3]。低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor,HIF)是人体对适应低氧环境的关键转录因子，在急性低氧反应中发挥关键作用[4]。近年来，肠功能障碍对sepsis结局的影响受到研究者重点关注。Sepsis早期肠上皮细胞低氧能量障碍是肠功能障碍重要诱因，机体可能通过上调HIF-1α,促进能量代谢，改善脓毒性肠道黏膜屏障(intestinalmucosalbarrier,IMB)损伤，二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxallylglycine,DMOG)是脯氨酰羟化酶的抑制剂，可以抑制脯氨酰羟化酶从而上调HIF-1α表达；而拮抗剂BAY87-2243作用相反，下调HIF-1α表达。本研究旨在探索HIF-1α激动剂DMOG或拮抗剂BAY87-2243对脓毒症大鼠肠道黏膜通透性作用。为sepsis肠道黏膜屏障功能损伤救治提供实验依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：

选择SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠24只，200～250g[浙江省医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK(浙)2-14-0001]。研究方案经过绍兴市人民医院动物伦理委员会议讨论通过(伦理审批文号：2020-009)。

1.1.2 主要试剂和设备：

二胺氧化酶(diamineoxidase,DAO)和肠型脂肪酸结合蛋白2(intestinaltypefattyacidbindingprotein2,I-FABP/FABP2)试剂盒(Cloud-Clone公司);D-乳酸(D-lactic)试剂盒(Abebio公司);荧光素标记的右旋糖苷(fluoresceinisothiocyanate-dextran,FD4)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma-Aldrich公司);HIF-1α、ZO-1(zonulaoccludens-1)、occludin、claudin-1和GAPDH一抗(Abcam公司);二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxaloylglycine,DMOG)和BAY87-2243(MedChemExpress公司);辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG(Jackson公司)。SpectraMaxPlus全波长酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司);ChemiDocXRS凝胶成像系统和Quantityone4.6图像处理与分析系统(Bio-Rad公司);R510IP小动物麻醉机(深圳瑞沃德公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理：

将大鼠随机数字法分为sham组(n=6)、sepsis组(n=6)[用盲肠结扎穿孔(ligationandperforation,CLP)]、(sepsis+DMOG)组(n=6)[CLP术前连续7d腹腔注射DMOG(40mg/kg)];(sepsis+BAY87-2243)组(n=6)[CLP术前连续3d灌胃BAY87-2243(9mg/kg)]。

1.2.2 标本的采集与处置：

大鼠采用七氟烷麻醉后，分离出4cm小肠，用手术缝线分别结扎肠管两端，将50μg的FD4,药物配制浓度为100mg/mL,注入肠管内，1h后取门静脉0.5mL,用于测定FD4血浆浓度。之后取腹主动脉血2mL,低温离心后分装置于-80℃保存，用于检测DAO、FABP2、D-lactic血浆浓度。距离盲肠部2cm处取1cm回肠组织数段，部分制成蜡块用于形态学研究；部分分装置于-80℃存储，用于检测肠黏膜紧密连接(tightjunctions,TJs)和HIF-1α蛋白的表达。随后颈椎脱臼法处死大鼠。

1.2.3 HE染色检测大鼠肠黏膜形态学变化：

常规HE染色光镜下观察小肠黏膜形态学改变，采用Chiu's评分定量判定小肠组织损伤程度。

1.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测DAO、FABP2和D-lactic血浆浓度：

按照ELISA试剂盒说明书检测各标本DAO、FABP2和D-lactic血浆表达水平。每个样本和标准品均设3个复孔，获得酶标仪450nm处吸光值(A),根据吸光值绘制标准曲线，计算各样本DAO、FABP2和D-lactic的含量，取平均值。

1.2.5 FD4浓度的测定：

解冻后血浆作1∶8倍稀释，转移到96孔板，每个标本做个复孔，每个孔100μL。用荧光酶标仪测定FD4血浆浓度。激发波长和发射波长分别设定为490nm和520nm。

1.2.6 Westernblot测定小肠黏膜TJs和HIF-1α蛋白的表达：

具体操作步骤按常规方法进行。

1.3 统计学分析

所有实验数据统计描述采用均数±标准差(x¯±s)表示。组间比较采用单因素方差(One-wayAnova)分析；组间比较差异有显著性，方差齐性数据使用LSD进行两两比较；方差不齐性数据采用DunnettT3检验。数据分析使用GraphPadPrism(7.0版本)统计学软件。

2、结果

2.1 HIF-1α激动剂或拮抗剂对sepsis大鼠肠黏膜病理形态的影响

Sham组大鼠肠黏膜完整，绒毛整齐(图1A);Sepsis组膜黏膜完整性破坏，肠绒毛萎缩脱落；(sepsis+DMOG)组大鼠肠绒损伤程度介于sham组和sepsis组之间；而(sepsis+BAY87-2243)组绒毛损伤比sepsis组更严重，甚至出现溃疡。Chiu's评分与黏膜损伤程度成正比，具体见图1A,B。

2.2 各组大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD4血浆的比较

与sham组相比，sepsis组大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD4血浆浓度均增高(P<0.05)(图2A～D)。与sepsis相比，(sepsis+DMOG)组DAO、FABP2、D-lactic和FD4血浆浓度均明显降低(P<0.05)(图2A～D);(sepsis+BAY87-2243)组大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD-4血浆浓度均显著升高(P<0.05)(图2A,D)。

2.3 各组大鼠肠黏膜组织TJs和HIF-1α表达的比较

与sham组相比，sepsis组大鼠肠黏膜组织中HIF-1α的表达水平上调(P<0.05)(图3A,B),而TJs蛋白(ZO-1、occludin和claudin-1蛋白)的表达水平明显下调(P<0.05)(图3A,C～E)。与sepsis相比(sepsis+DMOG)组肠黏膜组织中HIF-1α、ZO-1、occludin和claudin-1蛋白的表达均显著上调P<0.05);而(sepsis+BAY87-2243)组相反，肠黏膜组织中上述蛋白表达水平均下调(P<0.05)(图3,表1)。

3、讨论

Sepsis是一种危及生命的临床综合征，可导致自身组织和器官损伤，引起多个器官功能障碍[1]。危重患者肠道致病菌过度繁殖，肠黏膜受损，细菌毒素进入血循环，进而发展为全身性炎性反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)或多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfunctionsyndrome,MODS),因此，肠道是sepsis的“启动器官”。Sepsis中，肠黏膜微循环障碍，肠道黏膜屏障受损；通过肠道-淋巴通路使肠功能衰竭进一步恶化，肠道又是sepsis的“中心器官”[5]。

DAO和FABP2在肠黏膜细胞中表达，肠黏膜损伤细胞脱落时，快速释放进入血循环，可以作为肠黏膜损伤的特异性标志物[6]。D-lactic是肠道细菌的代谢产物，肠黏膜损伤致通透性增加时，D-lactic入血，哺乳动物不能代谢D-lactic,因此，血D-lactic浓度增加间接反映肠道通透性增加[6]。FD4是肠道通透性和肠道屏障改变的标志物[7]。本研究中，sepsis大鼠上述血浆标志物均升高，提示sepsis导致大鼠肠黏膜损伤，通透性增加。

TJs是维系细胞间链接与细胞屏障的重要组成部分。Occludin维持肠道物理特性，具有黏附功能；claudin-1形成细胞旁离子的选择性通道，影响着细胞间物质渗透率[8];ZO-1与多种细胞骨架蛋白绑定，对TJs起到支撑骨架作用[9]。本研究中，sepsis大鼠肠黏膜组织中TJs相关蛋白ZO-1、occluden、claudin-1的表达水平下降，病理形态破坏，提示sepsis导致大鼠肠黏膜形态结构破坏。

生理状态下，肠上皮细胞暴露于“生理性低氧”环境中，低氧环境是肠道共生菌生存的物质基础，并促进肠道物质运输[10];炎性反应时，氧耗增加、血管收缩导致氧供降低，肠上皮细胞出现缺氧[11]。本研究中，sepsis大鼠肠黏膜中HIF-1α表达明显增加，明显高于正常组，提示sepsis造成肠黏膜细胞缺氧，黏膜细胞通过自身代偿性HIF-1α的表达上调，以提高对缺氧的耐受并促进增殖维护肠道黏膜屏障的完整。既往研究使用HIF-1α激活剂明显减轻CLP引起小鼠肾脏损害[12]。在结肠炎小鼠中，HIF-1α激活剂AKB-4924能增强小鼠肠黏膜屏障功能，但是对HIF-1α缺陷小鼠无肠黏膜保护作用，表明肠黏膜HIF-1α是AKB-4924介导保护的组织靶点[13]。肠道HIF-1α敲除小鼠加剧肠酒精性肠道黏膜屏障的破坏[14]。通过敲除和过表达实验发现HIF在基因启动子水平上对claudin-1的表达起着基本的调节作用，揭示claudin-1可能是HIF的一个重要靶基因，HIF缺陷型肠黏膜claudin-1表达异常，导致TJs形态异常[15]。本研究中给予sepsis大鼠DMOG,sepsis大鼠肠道HIF-1α和TJs相关蛋白的表达上调，肠道黏膜损伤缓解。而给予BAY87-2243,出现HIF-1α和TJs相关蛋白表达下调，肠黏膜损伤缓解加重。

综上所述，sepsis时大鼠肠道黏膜屏障的结构和功能受到严重破坏，黏膜细胞通过自身调节HIF-1α表达上调。给予HIF-1α激动剂DMOG通过降低肠黏膜通透性，调节TJs中claudin-1而发挥保护肠道黏膜屏障作用，缓解脓毒引起的肠道黏膜屏障损伤作用；而给予HIF-1α抑制剂BAY87-2243,作用相反。结果提示HIF-1α对sepsis大鼠通过降低肠黏膜的通透性，发挥对脓毒症肠黏膜损伤具有保护作用，具体机制有待于进一步探索。

文章来源：王玉龙,滕文彬,单跃,姚刘旭,何锐,李玉红,祝胜美.HIF-1α激动剂或拮抗剂对脓毒症大鼠肠道黏膜通透性的影响[J].基础医学与临床,2021,41(11):1618-1623.