牙囊细胞(DFCs)是牙周膜细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞的前体细胞，可分别形成牙周膜、牙骨质和牙槽骨[1]。鉴于DFCs在牙周组织分化发育中的特点、且具有显著的多向分化潜能以及在临床上较易获得，使其成为了一种理想的种子细胞[2]。

Ca2+几乎参与了细胞所有的生理过程。Ca2+调控细胞生物学功能的基础在于细胞外与胞浆以及细胞内钙库(内质网或肌浆网)与胞浆存在Ca2+的浓度差，离子通道介导的Ca2+内流引起细胞内Ca2+浓度的增高，继而通过激活内质网的雷诺定受体或三磷酸肌醇受体，引起钙库大量释放Ca2+,最终触发钙信号[3]。电压门控钙通道是介导兴奋性细胞如神经细胞、心肌细胞Ca2+内流的主要离子通道[4]。近年来有研究表明，电压门控钙通道在非兴奋性细胞如干细胞也发挥了重要的作用。如Barradas等[5]报道L型电压门控钙通道可以通过调控骨形态发生蛋白信号通路参与人间充质干细胞成骨分化的调控过程。

DFCs的成骨分化是一个复杂的、受多因素调控的过程[6]。前期研究发现，提高细胞外Ca2+的浓度能够促进hDFCs成骨分化，提示离子通道介导的钙离子内流在hDFCs成骨分化的过程中发挥了关键的作用[7]。Nelson等[8]报道瞬时感受器电位通道TRPM4参与了大鼠DFCs成骨分化的调控。此外，有研究表明，电压门控钙通道参与了牙周膜干细胞成骨分化的调控过程[9]。而hDFCs同样作为牙源性干细胞，电压门控钙通道是否参与了hDFCs成骨分化的调控尚未见报道。因此，本研究初步探讨电压门控钙通道介导的钙离子内流在hDFCs成骨分化过程中的作用。

1、材料与方法

1.1 主要试剂

胎牛血清(FBS,Gibco,美国);α-MEM培养基、胰蛋白酶(上海碧云天生物技术有限公司);Ⅰ型胶原酶(Biosharp白鲨生物科技有限公司);青霉素-链霉素双抗、氯化钙(Sigma,美国);成骨诱导液、成脂诱导液(Cyagen,美国);波形丝蛋白(Vimentin)抗体、角蛋白(CK14)抗体(Abcam,英国);BAPTA(Invitrogen,美国);EGTA、Amiloride(MCE,美国);Nifedipine(索莱宝，中国);KN-93(MCE,美国);TritonX-100(上海碧云天生物技术有限公司);总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司);Rever-TraAceqPCRRTMasterMix(Toyobo,日本);SYBRGreenPCRKit(Qlagen,德国)。

1.2 实验方法

1.2.1 hDFCs的分离及培养

收集就诊于西南医科大学附属口腔医院颌面外科12～18岁因正畸或其他情况需要拔除的健康的未发育完全的第三磨牙的牙囊组织纳入研究患者及家属知情同意，本方案经西南医科大学附属口腔医院伦理委员会批准，伦理批审号：2018053001。用含20%双抗的基础培养基收集离体的牙囊组织，于2h内进行原代细胞分离培养。先用含20%双抗的PBS冲洗牙囊组织2～3次直至牙囊组织呈白色，再剪碎组织为1mm3大小的块状，低速离心后弃上清，用3mg/LⅠ型胶原酶于37℃下消化组织块30min,每10min晃动离心管使之充分消化后，加入等量含10%FBS的α-MEM培养液终止消化，离心弃上清，接种于培养瓶中，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱中培养，12h后翻瓶。每3d换液，约6d可见细胞呈放射状从组织块周围长出，待细胞长满约70%体积的培养瓶时进行传代。

1.2.2 免疫荧光染色及流式细胞术鉴定hDFCs来源

取第2代生长良好的hDFCs经酶消化后接种于细胞爬片上，待细胞密度达到50%～60%时，4%多聚甲醛固定20min,0.25%TritonX-100处理15min,3%过氧化氢处理15min,10%山羊血清37℃封闭30min,再滴加一抗波形丝蛋白(Vimentin,1∶400稀释)和角蛋白(CK14,1∶400稀释);置于37℃孵育1h,PBS洗涤，避光滴加荧光二抗(1∶200稀释);37℃光孵育1h,DAPI染色1min,置于荧光显微镜下观察。取第2代细胞经胰酶消化后，1000r/min离心5min,PBS冲洗3～4遍后重悬细胞；分装至Ep管(每管1μL),2000r/min离心6min,弃上清后混匀细胞，加1μL相应抗体；4℃避光孵育30min,各管加1mLPBS,2000r/min离心6min,重复2遍，最后加0.5mLPBS重悬，置于流式细胞仪上检测。

1.2.3 hDFCs成骨、成脂分化能力检测

将生长状况良好的第3代hDFCs接种于小皿中，待细胞融合至约80%,更换为成骨、成脂诱导液，每3d换1次液，诱导21d。PBS多次漂洗，4%甲醛固定后进行茜素红染色、油红O染色，采集直观图，镜下观察钙结节及油脂形成情况。再行茜素红半定量分析，加入10%氯化十六烷基吡啶2mL,充分混匀后置于96孔板中，于562nm处下检测A值。

1.2.4 RT-PCR检测hDFCs成骨分化相关基因的表达

取第3代hDFCs,将hDFCs以2×104/cm2的密度接种于6孔板，待细胞生长至70%～80%时，更换为相应的培养基，每隔3d换液1次，培养至21d时。以Trizol法提取总RNA,使用分光光度计检测RNA的浓度和纯度。按照Toyobo反转录试剂盒说明书合成cDNA,反应条件为：37℃、15min,50℃、5min,95℃、5min。将cDNA模板按照试剂盒说明书进行扩增，反应体系如下：2×SGFastqPCRMasterMix10μL,10μmol/L正义引物0.4μL,10μmol/L反义引物0.4μL,模板DNA2μL,ddH2O7.2μL,总反应体系20μL。反应条件如下：激活温度95℃、时长2min,变性温度95℃、时长5s,退火温度60℃、延伸时间30s,循环40次。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参分析T型钙通道亚基的表达。GAPDH正义链：5'-CAATGACCCCTTCATTGACC-3',反义链：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3';骨钙素(OCN)正义链：5'-GCCAGGCAGGTGCGAAGC-3',反义链：5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGTCC-3';RUNX2正义链：5'-GCAGCAGCAGCAGCAGGAG-3',反义链：5'-GCACCGAGCACAGGAAGTTGG-3';雷诺定受体(RyR)正义链：5'-TAGATTTATAAGGGGCCTTG-3',反义链：5'-GATTCTTCAGGGCTCGTAGT-3';三磷酸肌醇受体(IP3R)正义链：5'-GAAGAAACTACAGCACGCTG-3',反义链：5'-TTCTCCAGTAAAGCAGGTAA-3';CACNA1H正义链：5'-GCATGCTACTCCTGGCTTTC-3',反义链：5'-CCAAGAGGGAACATGTGCTT-3';Cav1.1正义链5'-GACATAATTCCCGCTGCCTG-3',反义链：5'-GTTTCCATTCTTCACCCGCC-3'。根据公式：-ΔΔCt=(对照组目标基因Ct值-对照组内参基因Ct值)-(待测样品Ct值-待测样品内参基因Ct值),2-ΔΔCt计算基因相对表达量。

1.3 统计学处理

采用SPSS20.0软件包进行统计学分析，检测结果以x¯±s表示，多组样本均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 hDFCs的分离、培养以及钙信号基本组成原件的鉴定

采用组织块结合酶消化法对hDFCs进行原代培养，6d左右可见长梭形细胞呈放射状从组织块周围爬出。hDFCs经过成骨、成脂诱导21d后，茜素红染色后镜下可见钙结节(图1a),油红O染色后镜下可见脂滴(图1b)。免疫荧光染色结果显示，hDFCs波形丝蛋白(Vimentin)呈阳性表达(图1c),角蛋白(CK14)呈阴性表达(图1d)。RT-PCR结果显示，hDFCs表达L型钙通道、T型钙通道、雷诺定受体以及三磷酸肌醇受体(图2)。

2.2 细胞外Ca2+对hDFCs成骨矿化的影响

hDFCs经成骨诱导21d后，茜素红染色结果显示，对照组细胞(成骨诱导液中含有1.8mmol/LCa2+)可见大量成骨矿化结节(图3)。用EGTA(0.05mmol/L)螯合细胞外Ca2+后，细胞的成骨矿化能力明显受到抑制(图3),茜素红半定量分析显示：在562nm下测得A值，EGTA组(0.34±0.08)相比对照组(1.34±0.05,P<0.01),明显降低，表明EGTA对hDFCs的矿化能力有显著抑制作用。

2.3 细胞内Ca2+对hDFCs成骨矿化的影响

hDFCs经成骨诱导21d后，茜素红染色结果显示，对照组细胞可见大量成骨矿化结节(图4)。用BAPTA(20μmol/L)螯合细胞内Ca2+后，细胞的成骨矿化能力明显受到抑制(图4)。茜素红半定量分析显示：在562nm下测得A值BAPTA组(0.68±0.02)相比对照组(1.34±0.09,P<0.05)明显降低，表明BAPTA对hDFCs的矿化能力有显著抑制作用。

2.4 电压门控钙通道对hDFCs成骨矿化的影响

hDFCs经成骨诱导21d后，茜素红染色结果显示，对照组细胞可见大量成骨矿化结节(图5)。与对照组细胞比较，用Nifedipine(20μmol/L)阻断L型钙通道后，细胞成骨矿化能力没有发生明显变化(图5)。用Amlioride(100μmol/L)阻断T型钙通道后，细胞成骨矿化能力收到明显抑制(图5)。茜素红半定量分析显示在562nm下测得A值，Nifedipine组(1.35±0.15)相比对照组(1.41±0.06,P>0.05)无差异，而Amlioride组(0.48±0.02)相比对照组(1.41±0.06,P<0.01)明显降低，表明Amlioride对hDFCs的矿化能力有显著抑制作用。

2.5 Ca2+/CaMKⅡ信号通路对hDFCs成骨分化的影响

hDFCs在含有5mmol/LCa2+的营养基中培养10d后，茜素红染色可见大量成骨矿化结节(图6)。与对照组细胞相比较，用KN-93(10μmol/L)阻断Ca2+/CaMKⅡ信号通路后，细胞外Ca2+对细胞成骨矿化的促进作用明显减弱(图6)。茜素红半定量分析在562nm处测得A值KN-93组(0.75±0.10)相比对照组(1.32±0.05,P<0.05)明显降低，表明KN-93对hDFCs的矿化能力有抑制作用。

2.6 成骨分化相关基因的表达

以GAPDH为内参mRNA,在加入抑制剂Nifedipine(20μmol/L)及Amlioride(100μmol/L)诱导21d后，RT-qPCR检测成骨相关基因RUNX2、OCN的表达，结果表明，与对照组mRNA表达水平(1.15±0.09)相比，Nifedipine组OCN、RUNX2基因的mRNA表达水平分别为1.09±0.05、0.96±0.04,两者之间无差异，而Amlioride组OCN、RUNX2基因的mRNA表达水平分别为0.72±0.06、0.69±0.12,均显著低于对照组(P<0.05)。表明加入Amlioride(100μmol/L)后能显著抑制RUNX2、OCN基因的表达。

3、讨论

本研究首先观察细胞外Ca2+(1.8mmol/L)对hDFCs成骨分化能力的影响。发现在成骨诱导条件下，对照组细胞(成骨诱导液中含有1.8mmol/LCa2+)具有较强的成骨分化能力；而去除细胞外Ca2+后，细胞的成骨分化能力明显受到抑制。上述结果表明，细胞外Ca2+在hDFCs成骨分化的过程中起到了关键的作用。以往研究表明，在干细胞分化的过程中常伴随着细胞内Ca2+浓度的增高。Kawano等[8]发现，在人间充质干细胞成脂分化的过程中细胞内Ca2+浓度是升高的，但在成脂分化结束后细胞内Ca2+浓度又恢复到正常水平。Koori等[9]报道，对人间充质干细胞进行电刺激会引起Ca2+的内流并促进成骨分化。本研究发现在螯合细胞内Ca2+后，hDFCs的成骨分化能力也明显受到了抑制。上述结果说明，离子通道介导的Ca2+内流引起的细胞内Ca2+浓度的增高在hDFCs成骨分化的过程中起到了至关重要的作用。

电压门控钙通道介导的钙致钙释放是细胞外Ca2+调控细胞钙信号的主要分子机制之一[10]。本实验首先采用RT-PCR的方法对hDFCs的钙信号基本组成原件进行了鉴定。发现hDFCs表达L型钙通道、T型钙通道、雷诺定受体以及三磷酸肌醇受体。这一结果提示，电压门控钙通道介导的钙离子内流可以通过钙致钙释放的机制引起hDFCs胞内Ca2+浓度的增高。为了进一步鉴定电压门控钙通道介导的Ca2+内流对hDFCs成骨分化的影响。本研究使用特异性阻断剂来阻断L型或T型钙通道介导的Ca2+内流，观察成骨诱导条件下细胞的成骨分化能力。发现阻断L型钙通道对hDFCs的成骨分化能力没有影响。但阻断T型钙通道能够明显抑制hDFCs的成骨分化能力。以往研究表明，约15%的未分化人骨髓间充质干细胞表达L型钙通道[11,12]。目前，L型钙通道对间充质干细胞成骨分化能力的影响尚存争议。Wen等[13]报道抑制L型钙通道的功能能够抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。而Ma等[14]在小鼠骨髓间充质干细胞的研究表明，抑制L型钙通道能够促进细胞的成骨分化能力。本研究发现L型钙通道阻断剂Nifedipine对hDFCs的成骨分化能力没有影响，而T型钙通道特异性阻断剂Amlioride能够明显抑制hDFCs的成骨分化能力。

已有文献报道，T型钙通道参与了神经干细胞以及人诱导式多能干细胞生物学特性的调节。如Kim等[15]以及张熙等[16]报道，T型钙通道是维持神经干细胞活性以及增殖的关键离子通道。但目前尚没有证据显示T型钙通道参与间充质干细胞生物学特性的调控过程。本研究结果证明了T型钙通道也参与了间充质干细胞成骨分化的调控过程。钙结合蛋白钙调素(CaM)参与细胞内多种信号转导途径，并在Ca2+依赖性信号转导途径中起到关键作用，并向下游传递信号。CaM由Ca2+激活，其中CaMKⅡ又在调节细胞增殖、分化和基因表达中起着关键作用。Feng等[17]发现CaMKⅡ在骨髓间充质干细胞的软骨形成中起重要作用。另有研究发现钙通道介导的Ca2+内流激活Ca2+/CaMKⅡ信号通路从而调控人骨髓间充质干细胞的成骨分化[18]。本研究发现在使用CaMKⅡ特异性阻断剂KN-93后，细胞外Ca2+对hDFCs成骨分化的促进作用明显受到抑制，说明细胞外Ca2+的内流是通过激活Ca2+/CaMKⅡ信号通路参与hDFCs成骨分化的调控。

本研究首先证明了细胞外Ca2+以及细胞内Ca2+参与了hDFCs成骨分化的过程。其次，证明了hDFCs表达调控钙信号的基本组成原件如电压门控钙通道、三磷酸肌醇受体以及雷诺定受体。最后，证明了T型钙通道及Ca2+/CaMKⅡ信号通路参与了hDFCs成骨分化的过程，也证明了T型钙通道参与间充质干细胞生物学特性的调控过程。推测电压门控钙通道介导的Ca2+内流及其诱发的细胞内钙库钙释放从而激活Ca2+/CaMKⅡ信号通路是调控hDFCs成骨分化的重要分子机制，但其下游信号通路仍需进一步验证。

参考文献:

[6]何梦婷,白丁.牙囊在牙萌出的作用及其调控机制研究进展[J].口腔医学研究,2020,36(2):107-110.

[7]赵娴,曾锦,左东川,等.钙离子对人牙⑴细胞增殖､迁移和成骨分化的影响[J].上海口腔医学,2019,28(6):572-577.

[16]张熙,娄淼,周乐,等.脑外伤后T型钙通道对神经干细胞增殖的诱导作用[J].西安交通大学学报:医学版,2016,37(4):.484-488.

文章来源：杨晶晶,左东川,谢沂航,蔡欣,袁小平,曾锦.T型钙通道对人牙囊细胞成骨分化的影响[J].口腔医学研究,2021,37(10):900-905.