首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 卵巢癌论文 > HDAC3在卵巢癌中的表达及其对癌细胞焦亡通路的影响

HDAC3在卵巢癌中的表达及其对癌细胞焦亡通路的影响

2025-08-12 29 上传者：管理员

摘要：目的：研究HDAC3在卵巢癌中的表达及其对癌细胞焦亡通路的影响。方法：从北华大学附属医院生物样本库中收集28例上皮性卵巢癌患者的癌组织及癌旁组织，通过免疫组化染色分析HDAC3在上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中的阳性率；将上皮性卵巢癌SKOV3细胞分为3个实验组：空白对照组、si NC组、si HDAC3组。通过EDU染色实验分析SKOV3细胞的增殖活性；通过流细胞术分析SKOV3细胞的凋亡率；通过蛋白免疫印迹实验分析SKOV3细胞中HDAC3及细胞焦亡相关蛋白的表达。结果：与癌旁组织比较，HDAC3在上皮性卵巢癌组织中表达增加(P<0.05)。与空白对照组和si NC组比较，si HDAC3组的SKOV3细胞增殖能力下降，凋亡率增加，焦亡相关蛋白(NLRP3、ASC、Caspase-1)表达增加(P<0.05)。结论：HDAC3在上皮性卵巢癌组织中表达增加。抑制HDAC3表达后，上皮性卵巢癌SKOV3细胞的增殖活性降低，凋亡率增加，这一过程可能与HDAC3调控细胞焦亡通路有关。

关键词：
HDAC3
NLRP3
SKOV3
上皮性卵巢癌
细胞焦亡
加入收藏

卵巢癌是一种威胁全球妇女健康的恶性肿瘤,由于缺乏有效的筛查策略,因此被发现时通常已处于晚期阶段[1,2]｡上皮性卵巢癌是最常见的卵巢癌类型,占所有病例的90%｡由于化疗耐药性的发生,大约80%的上皮性卵巢癌患者在标准一线治疗后会复发[3-5]｡因此,寻找上皮性卵巢癌进展过程中的关键靶点对于改善患者的预后具有重要意义｡

组蛋白去乙酰化酶3(his-tonedeacetylase3,HDAC3)是一种高度保守的I类组蛋白去乙酰化酶,在真核细胞中广泛表达｡目前研究发现,HDAC3在多种肿瘤中激活后能够通过Nod样受体蛋白3(nod-likereceptorprotein3,NLRP3)通路抑制肿瘤细胞的焦亡[6-8]｡例如,在乳腺癌中HDAC3高表达并与癌细胞焦亡相关[9]｡然而,目前HDAC3在上皮性卵巢癌中的表达及其对癌细胞焦亡通路的影响尚未明确｡因此,本研究通过分析HDAC3对上皮性卵巢癌细胞焦亡通路的影响,以期为上皮性卵巢癌的治疗提供新思路｡

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料

人上皮性卵巢癌细胞(sloan-ketteringovariancamcerline3,SKOV3)细胞株购自武汉益普生物公司｡从北华大学附属医院生物样本库中收集28例上皮性卵巢癌患者的癌组织及癌旁组织,本研究经北华大学附属医院医学伦理委员会批准,批准文号:2023072401｡

1.1.2试剂

细胞蛋白裂解液,100mL,北京百奥创新科技有限公司;HDAC3､NLRP3､凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingaCARD,ASC)､半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspaseprotease-1,Caspase-1)以及肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体,100μL,北京博奥森生物技术有限公司;结晶紫染液,纯度>96.7%,武汉贝茵莱生物科技有限公司;脂质体3000,纯度>95.2%,北京普利莱基因技术有限公司;HDAC3的siRNA(siHDAC3)､阴性对照siRNA(siNC),纯度>93.9%,北京恩泽康泰生物科技有限公司;胎牛血清,500mL,浙江天杭生物科技股份有限公司｡

1.1.3仪器

流式细胞仪,FACSCantoII,美国BD公司;倒置生物显微镜,NIB610,宁波永新光学股份有限公司;能酶标仪,bio-rad168-1130iMark,美国伯乐公司;冷冻高速离心机,M1324R,深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司;细胞培养箱WKN-NR48,日本威肯公司｡

1.2方法

1.2.1免疫组化分析

将上皮性卵巢癌及癌旁组织的临床样本制成石蜡切片后,切片用二甲苯和乙醇脱蜡脱水｡然后组织切片用柠檬酸盐沸水中反应10min｡接下来,切片在室温下用3%过氧化氢孵育10min｡用山羊血清封闭后,切片与一抗在4℃孵育过夜｡次日在室温下用磷酸缓冲液洗涤3次,用二抗室温孵育30min,最后用二氨基联苯胺和苏木精染色,封片后在显微镜下拍摄图像｡通过ImageJ1.8.0分析HDAC3的阳性染色率｡

1.2.2细胞培养

上皮性卵巢癌细胞系SKOV3细胞在添加了12%胎牛血清的RPMI1640培养液中培养,培养条件设定为(37.0±0.5)℃､湿度(35.0±1.0)%､CO2浓度(5.0±0.5)%｡待SKOV3细胞生长至培养皿底部约80%时,将SKOV3随机分配至3个实验组空白对照组､siNC组和siHDAC3组｡培养24h后,向各组中转染特定的siRNA(0.5μg),48h后进行后续实验｡

1.2.3脱氧尿嘧啶核苷染色实验分析SKOV3细胞增殖活性

将待转染的SKOV3细胞以1×105个/孔的密度培养于24孔板中,转染结束后,采用脱氧尿嘧啶核苷(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine,EDU)试剂检测各组SKOV3细胞增殖能力｡染色结束后,更换新的培养基,并在倒置荧光显微镜下进行拍摄细胞图像｡EDU阳性细胞的计算公式为EDU阳性细胞计数/总细胞计数×100%｡

1.2.4流式细胞术分析SKOV3细胞的凋亡率

各组细胞完成转染后,使用胰酶悬浮细胞并分别收集各组SKOV3细胞,磷酸缓冲液洗涤,从细胞密度为5×106个SKOV3细胞/mL的细胞悬液中取100μL的细胞悬液,并往其中补充加入5μL的AnnexinVFITC和5μL碘化丙啶(PI),避光孵育15min后,采用流式细胞术检测SKOV3细胞凋亡情况｡

1.2.5蛋白免疫印迹实验检测

各组细胞完成转染后,往各组细胞中加入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液以提取各组SKOV3细胞的总蛋白｡使用二喹啉甲酸检测来检测和计算蛋白质水平｡将等量(20μg)蛋白质加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中,目的蛋白分离开后将凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜中｡结束后将膜置于脱脂乳中封闭50min,经磷酸缓冲液洗涤后与一抗孵育过夜｡然后,将膜与第二抗体孵育,最后在凝胶系统中显影｡通过ImageLab6.2分析各蛋白的表达量｡

1.3统计学方法

采用GraphPadPrism9.0(GraphPadSoftware,Inc.)分析数据｡多组间比较采用单因素方差分析和Tukey事后检验,两组间比较采用非配对t检验｡数据以均数±标准差(xs)表示,P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1HDAC3在上皮性卵巢癌组织及癌旁组织中的表达

通过免疫组化分析HDAC3的表达发现,与上皮性卵巢癌的癌旁组织比较,HDAC3在上皮性卵巢癌组织中阳性表达率增加,见图1,表1｡

图1HDAC3在上皮性卵巢癌癌组织及癌旁组织的免疫组化染色结果(400×)

表1HDAC3在上皮性卵巢癌组织中的表达

2.2SKOV3细胞中HDAC3的表达

通过蛋白免疫印迹实验发现,与空白对照组和siNC组比较,siHDAC3组的SKOV3细胞的HDAC3表达明显降低,见图2,表2｡

图2SKOV3细胞中HDAC3的表达

表2SKOV3细胞中HDAC3的表达

2.3HDAC3对SKOV3细胞增殖能力的影响

通过EDU染色实验发现,与空白对照组和siNC组比较,siHDAC3组的SKOV3细胞增殖活性降低,见图3,表3｡

图3SKOV3细胞的EDU染色结果(200×)

表3HDAC3对上皮性卵巢癌SKOV3细胞株增殖的影响

2.4HDAC3对SKOV3细胞凋亡的影响

采用流式细胞分析术分析发现,与空白对照组和siNC组比较,siHDAC3组的SKOV3细胞凋亡率增加,见图4,表4｡

图4HDAC3对SKOV3细胞凋亡的影响

表4HDAC3对SKOV3细胞凋亡的影响

2.5HDAC3对SKOV3细胞焦亡通路的影响

通过分析SKOV3细胞的NLRP3/ASC/Caspase-1蛋白发现,与空白对照组和siNC组比较,siHDAC3组SKOV3细胞的NLRP3､ASC､Caspase-1蛋白表达增加,见图5,表5｡

图5HDAC3对SKOV3细胞焦亡通路的影响

表5HDAC3对SKOV3细胞焦亡通路的影响

3、讨论

上皮性卵巢癌是卵巢癌中最常见的类型,占所有卵巢癌的95%以上｡上皮性卵巢癌是通常发生在卵巢表面的上皮细胞中的癌症,根据组织学分类,可以分为高级别浆液性､低级别浆液性､透明细胞､内膜样和粘液性卵巢癌[2,3]｡上皮性卵巢癌是女性生殖系统中导致死亡的首要原因,在全球范围内,卵巢癌是第三常见的妇科癌症｡由于其非特异性的临床症状和缺乏预防性筛查方法,导致大多数患者在确诊时已处于晚期,因此预后较差[5]｡随着医学分子生物学的不断发展,探索与上皮性卵巢癌进展相关的生物标志物已成为研究热点｡HDAC3是一种高度保守的I类组蛋白去乙酰化酶,研究发现,HDAC3在乳腺癌等妇科肿瘤中表达上调,并能参与肿瘤细胞的增殖､凋亡等过程[6,7]｡与HDAC3在其他肿瘤中的研究结果相似,本研究发现,HDAC3在上皮性卵巢癌组织中表达增加,通过抑制上皮性卵巢癌SKOV3细胞的HDAC3表达后,观察到SKOV3细胞的增殖活性降低,凋亡率增加｡这一结果提示,HDAC3可能是治疗上皮性卵巢癌的潜在靶点｡

细胞焦亡是一种程序性细胞死亡的形式,属于炎症性细胞死亡,通常由激活的炎症小体(如NLRP3)和相关的半胱天冬酶(如Caspase-1)引发｡细胞焦亡与机体的防御､炎症､自身免疫性疾病和许多其他系统性疾病中均存在着紧密的联系[10,11]｡此外,细胞焦亡在肿瘤的发生､发展和治疗中扮演着关键角色｡研究表明,一些化疗药物通过诱导细胞焦亡发挥抗肿瘤效果｡例如,顺铂在三阴性乳腺癌中通过激活NLRP3/Caspase-1途径诱导细胞焦亡,从而发挥抗肿瘤效果[12]｡此外,细胞焦亡还可以增加CD4+T细胞和CD8+T细胞的浸润,从而增强对肿瘤的免疫监视和清除[13]｡既往研究证明,在卵巢癌的进展中,细胞焦亡与肿瘤微环境､免疫反应和肿瘤细胞的死亡密切相关[14,15]｡因此,促进癌细胞焦亡可能是治疗上皮性卵巢癌的新方案｡本研究发现,在抑制上皮性卵巢癌细胞中的HDAC3表达后,细胞焦亡通路NLRP3/ASC/Caspase-1激活,结合前面的研究结果可以认为,抑制HDAC3后导致SKOV3细胞的增殖活性降低和凋亡率增加可能与NLRP3/ASC/Caspase-1信号通路的激活相关｡因此,HDAC3可能通过抑制NLRP3/ASC/Caspase-1通路促进上皮性卵巢癌进展｡本研究使用SKOV3细胞系进行体外实验,虽然SKOV3细胞是常用的卵巢癌细胞模型,但其并不能完全代表所有卵巢癌细胞的生物学特性｡因此,通过SKOV3细胞的实验结果来推断HDAC3在卵巢癌中的作用机制,可能存在一定的局限性｡在后期研究工作中,将纳入更多的卵巢癌细胞系以及卵巢癌动物模型来进一步验证本研究的结论｡

综上所述,本研究发现,HDAC3在上皮性卵巢癌组织中表达增加｡抑制上皮性卵巢癌SKOV3细胞的HDAC3表达后,SKOV3细胞的增殖活性降低,凋亡率增加,并且HDAC3对卵巢癌的作用可能与调控细胞焦亡通路相关｡

参考文献:

[1]黄成琳,张淑兰.核酸适配体在卵巢癌诊断中的研究进展[J]中国医学前沿杂志(电子版),2024,16(8):78-84.

[2]刘易陇,何霞,宋学武,等.基于肿瘤增殖和免疫相关生物标志物的卵巢癌患者预后预测的临床研究[J].中国临床药理学杂志,2024,40(2):195-199.

[3]侯倩男,袁宇,李燕,等.血清中CDO1基因与HOXA9基因启动子甲基化高表达在卵巢癌诊断中的意义[J].中华检验医学杂志,2024,47(4):401-406.

[4]周明慧,江彦君,宋术义,等.卵巢癌结构域蛋白酶-1基因拮抗IFN-α抗病毒效应研究[J].中华微生物学和免疫学杂志,2024,44(5):382-389.

[5]王娟,刘蕾蕾,李琰,等.CDH1单核苷酸多态性与上皮性卵巢癌患者临床预后的关联性[J].河北医药,2024,46(11):1611-1616.

[6]赵云飞,何姣,杨玲,等.乳腺癌组织中miR-502和HDAC3表达的相关性及其临床意义[J].中南医学科学杂志,2021,49(4):447-451.

[7]汪自然,马凡,丁篷生,等.LukS-PV通过下调HDAC3抑制肝癌细胞增殖[J].安徽医科大学学报,2020,55(6):926-931.

[8]唐小淋,卢从华,毕万达,等.HDAC3影响二甲双胍抑制非小细胞肺癌增殖的实验研究[J].肿瘤预防与治疗,2023,36(12):1009-1015.

[9]商平平,张颜明,王向臣,等.组蛋白去乙酰化酶3通过调节miR-625/ASF1B轴抑制乳腺癌细胞焦亡[J].中华内分泌外科杂志,2022,16(5):541-547.

[10]田胜,吴伟.细胞焦亡及其在神经病理性疼痛中作用的研究进展[J].中国疼痛医学杂志,2024,30(4):290-295.