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不同培养时长的人外周血淋巴细胞G显带染色体制备的优化

2024-12-24 78 上传者：管理员

摘要：目的：探索外周血淋巴细胞经培养不同时长后制备可用于临床诊断的G显带染色体的可行方法。方法：外周血全血接种后常规培养68～72 h为对照组，根据培养时长分24、48、96、120 h组共4个实验组，对接种细胞培养时间、秋水仙素作用浓度、接种细胞浓度共三个因素进行三轮比较实验，比较不同实验组的分裂指数、染色体显带效果，摸索不同培养时长组的最佳实验条件。结果：外周血淋巴细胞培养48 h组接种22滴外周血全血、秋水仙素工作浓度0.14μg/mL组和培养96 h组接种20滴外周血全血、秋水仙素工作浓度0.06μg/mL制片效果与对照组没有显著差异。结论：不同培养时长的外周血淋巴细胞可通过调整接种细胞量和秋水仙素的工作浓度达到常规培养68～72 h的制片和分析效果，应用临床可实现弹性化批量标本处理，极大提高实验室检测效率。

关键词：
G带制片
复发流产
外周血淋巴细胞
核型分析
细胞培养时长
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外周血淋巴细胞染色体核型分析是临床细胞遗传学诊断最经典､有效的检测方法,在肿瘤､血液疾病､出生缺陷筛查[1] ､不孕不育[2] ､复发流产等疾病的诊断和治疗中意义重大｡足够数量的中期分裂相和条带清晰的染色体方能满足对染色体数目异常和结构畸变的临床遗传学诊断需要｡

近年来,随着临床检测要求的提高,细胞遗传学实验室染色体制备的常规方法有了更多的优化｡接种培养淋巴细胞的纯度[3] ､中期细胞的拦截[4-5] ､低渗条件[6] ､固定液组成和体积[7-8] ､固定次数､滴片条件[9] ､烤片老化时间[10] 和显带[11] 染色等环节都有了改良,因而制备得到的可分析染色体的数量和质量更为理想,可以辅助临床提高诊断的准确率｡

以上方法改良都是基于外周血淋巴细胞培养68~72 h 做出的优化,能否通过缩短或者延长培养时间和优化培养条件获得满意的染色体核型,使得不同就诊时间的患者样本可进行批量检测,这对简化实验室操作､缩短报告时间十分重要｡本研究拟探讨缩短培养时间到 24 h 和 48 h､延长培养时间到 96 h 和 120 h 的外周血染色体制备方法,比较不同培养时长的外周血样本经过条件优化制备出的染色体样本的分裂指数和染色体显带效果｡

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源与接种方法建立时留取 2019 年 9 月-2020 年 10 月来本院不孕不育门诊行外周血染色体核型检查夫妇的抗凝静脉血 5 mL,溶血､凝血样本不用于实验｡

1.1.2 实验分组实验共分三轮进行,每组 20 个样本｡ ⑴不同培养时间:对照组采用常规方法即 5 mL 培养基中接种 20 滴外周血､培养时长 68 ~ 72 h, 实验组分为接种后培养 24 h 组､48 h 组､96 h 组和 120 h 组;⑵不同秋水仙素浓度:细胞培养 48､72､96 h 后,48 h 组分别加入 10 μg / mL 秋水仙素母液 50､ 60､70 μL,使秋水仙素工作浓度分别为 0.1､0. 12､ 0. 14 μg / μL,96 h 组则加 30､40､50 μL,使秋水仙素工作浓度分别为 0.1､0.08､0.06 μg / μL,对照组(72 h)加母液 50 μL 即浓度 0.1 μg / μL,作用 3 h 后同时进行收获;⑶不同接种细胞浓度:对照组接种细胞浓度为 20 滴,48 h 组接种细胞浓度为 20 滴､22 滴､24 滴,96 h 组接种细胞浓度 20 滴､18 滴､16 滴,每个接种浓度亚组秋水仙素工作浓度同第二轮同培养时长组最优条件｡

1.1. 3 仪器与试剂 CO2 培养箱型号 ( 型号 Thermo3111),水浴箱 ( 上海精宏,型号 DK - 600S 型),低速离心机型号 ( 安徽中科中佳, KDC - 1044L),苏州净化超净工作台,Olympus 显微镜(型号 BX51),北昂全自动染色体图像扫描分析系统 (型号 LABB M9);淋巴细胞培养基(青岛莱佛生物工程研究所),秋水仙素(青岛莱佛生物工程研究所),胰蛋白酶(Sigma,货号 P7545-25 g),姬姆萨染液(珠海贝索,货号 BA4017), 甲醇､冰醋酸､ KCl､ NaCl､ KH2PO4 ､ Na2HPO4 等均为武汉中天化工有限公司产品｡

1.2 细胞培养与中期细胞拦截

肝素抗凝的外周血接种于1640 培养基后于 CO2 培养箱分别培养,收获前 3 h 加入秋水仙素｡

1.3 染色体制备

操作前将实验区域温度控制在23 ~ 26 ℃ ,湿度 60% ~65%｡将培养细胞转入 15 mL 尖底离心管中, 1500 r/ min 离心 10 min 后,弃上清液,加入已 37 ℃ 预温的 0.075 mol / L 氯化钾溶液 8 mL,吹打均匀后置于 37 ℃水浴箱中温育 30 min,期间轻吹打 1 次｡温育结束后每管加入新鲜配制的固定液(甲醇 ∶ 冰乙酸 = 3 ∶ 1) 1 mL,轻轻混匀后放置室温 5 min｡ 1500 r/ min 离心 10 min,弃上清液,加入固定液 8 mL 吹打混匀,固定 10 min 离心,重复上述步骤一次｡最后向沉淀中加入 200 ~ 500 μL 的固定液, 调成略浑浊的细胞悬液｡将细胞悬液 2 滴滴在-20 ℃ 预冷的洁净湿片上,酒精灯外焰过火 8 次后烤箱 70 ℃过夜,次日自然降温后消化显带｡

1.4 G 显带和染色

实验区温度和湿度控制同上一步｡37 ℃ 水浴胰酶工作缓冲液(浓度 0.025%,pH 7.2)消化 45 ~ 60 s,0.9%氯化钠溶液中清洗一次,染色工作液(姬姆萨染液与磷酸盐缓冲液比例为 1 ∶ 5) 中染色 2 ~ 5 min,自来水轻冲洗两面后晾干｡

1.5 培养成功率计算

标本玻片可见20 个以上分裂相染色体判断为培养成功, 培养成功率 = 培养成功样本数/ 20 × 100%｡

1.6 细胞分裂指数计算

每份标本低倍(放大倍数 100 倍) 显微镜下计数 20 个视野,分别计数分裂期和非分裂期细胞,计算细胞分裂指数｡细胞分裂指数(%)= 分裂期细胞数/ 全部细胞数×100%｡分析固定由同一名人员完成,另一名人员复核｡

1.7 制片效果判断

全自动染色体图像扫描系统上每一张染色玻片采集图像80 个,按照不合格､合格､优等三个等级计算百分率来判断制片效果｡显带不足 320 条带､染色体长度较短或者过长缠绕,显带水平 400 条带核型数不足 5 个判为不合格样本,合格率 = (20-不合格样本数) / 20×100%;染色体无交叉的优质核型率大于 50%､最佳显带率不低于 400 条带判为优等样本,优等样本率=优等样本数/ 20×100%｡

1.8 统计学方法

采用SPSS 24.0 进行配对样本双侧 t 检验,P< 0. 05 为差异有显著意义｡

对照组和实验组均可获得染色体｡其中培养24 h 组和 120 h 组样本不合格率分别为 55%､50%, 与对照组差异显著(P = 0.018)｡ 24 h 组样本染色体过长且相互交叉重叠较多,而 120 h 组染色体长度短､显带水平低｡培养 48 h 和 96 h 组合格样本率与对照组差异无统计学意义(P>0.05),见表 1｡

2、结果

2.1 不同培养时间效果比较

表1 不同培养时间处理后染色体显带效果的合格率比较

2.2 不同秋水仙素浓度效果比较

2.2.1 分裂指数比较选择上一轮实验中能够获得足够中期分裂相的组别继续进行秋水仙素作用浓度优化｡ 48 h 组和 96 h 组的分裂指数相比对照组差异极显著,其中 48 h 组显著低于对照组,96 h 组显著高于对照组(P<0.001),见表 2｡

2.2.2 制片效果比较 48 h 组随着秋水仙素浓度的提高,显带合格率也提高,当秋水仙素浓度为 0. 14 μg / mL 时,合格样本率､优等样本率与对照组没有显著差异(P>0.05);96 h 组秋水仙素工作浓度为 0.06 μg / mL 时,制片效果与对照组没有显著差异( P >0. 05),见表 3｡

表2 不同秋水仙素浓度处理后有丝分裂指数的比较

表3 不同秋水仙素浓度处理后染色体制备效果比较

2.3 不同接种细胞浓度效果比较

选择上一轮实验中制片效果与对照组最接近的组进行接种细胞浓度优化｡48 h 组接种细胞浓度为 20 滴､22 滴､24 滴三个浓度梯度,96 h 组接种细胞浓度为 20 滴､18 滴､16 滴三个浓度梯度｡ 48 h 组接种细胞浓度 20 滴､22 滴制片效果与对照组差异不显著(P>0.05),接种细胞浓度 22 滴最优;96 h 接种细胞浓度 20 滴获得的样本与对照组差异不显著(P >0.05),其余两组样本合格率降低,与对照组差异显著(P<0.05),接种细胞浓度 16 滴组优等样本率与对照组比显著下降(P<0.05),见表 4｡

表4 接种细胞浓度改变对染色体样本制片的影响比较

3、讨论

体外培养的人外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)刺激下从静止期 G0 期进入 G1 期启动有丝分裂[12-13] ,是获得淋巴细胞中期分裂相的前提条件｡在 PHA 刺激下,有足够数量的淋巴细胞启动有丝分裂､选择适宜的时间使用秋水仙素(胺)阻滞即可收集细胞获得染色体核型｡ Lohrmann HP [14] 研究表明 PHA 刺激的淋巴细胞进入细胞周期的平均时间是 13.0~14.5 h,其中会在 S 期平均持续 8.3 h,G2 期平均持续 2.7 h｡同位素标记实验发现在培养 12 ~ 96 h 期间,培养 12 h 开始进入细胞周期,24 h 开始增加,最高是在 36 h,随后每 12 个小时逐步降低,96 h 后细胞不再进入细胞周期｡因此体外培养的淋巴细胞在 PHA 刺激超过 12 h 后加入秋水仙素拦截即可获得分裂中期细胞｡此外,外周血淋巴细胞长期体外培养可能发生免疫和遗传改变｡故本研究尝试培养 24~120 h,结果显示在淋巴细胞培养 24 ~ 96 h 均可获得足够量的分裂相,与 72 h 相比分裂指数有显著差异,但是分裂相质量可通过调整秋水仙素工作浓度获得无差异的制片效果｡

秋水仙素可防止微管(纺锤丝) 形成或者使微管/ 微丝解聚,使分裂周期细胞停滞在分裂中期从而获得染色体分裂相,因此在染色体制备中被广泛使用｡秋水仙素浓度过大或者处理时间长,可导致染色体变短,或发生异常分裂现象等情况;秋水仙素浓度过低或作用时间不够,则染色体形态偏长或无中期分裂相[15-16] ｡龙艳喜等[17]将淋巴细胞培养 96 h, 同时提高秋水仙素工作浓度､缩短作用时间,获得的染色体分裂相总数优于 72 h 组｡本研究结果显示 96 h 组与对照组无显著差异,但 48 h 组获得的染色体分裂相总数更多､优质分裂相更多,更有利于检测人员优化工作时间和提高效率｡

外周血淋巴细胞接种浓度过高可能抑制体外增殖[18] ,而浓度过低则会导致分裂相减少｡目前细胞接种浓度相关研究报道很少,故本研究探讨了接种外周血淋巴细胞浓度来优化染色体制片效果｡结果显示,48 h 组通过提高接种细胞浓度可达到 72 h 组正常细胞接种浓度相同效果,缩短临床检测时间｡

综上所述,本研究探索了不同培养时长､不同秋水仙素浓度以及不同外周血淋巴细胞接种浓度的外周血淋巴细胞染色体制备体系,可用于临床优化工作流程,尤其当检测样本量较少时,通过批量样本收获, 减少操作批次和时间,极大地提高了检测工作效率｡

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