摘要:目的建立一种测定人血浆中卡马西平游离浓度的中空纤维离心超滤(HFCF-UF)-超高效液相色谱(UPLC)法。方法血浆样本经中空纤维离心超滤技术预处理。色谱柱:WatersUPLCBEHC18柱(50.0mm×2.1mm,1.7μm),流动相:乙腈-水=35∶65,流速:0.2mL•min-1,柱温:30℃,进样量:2μL。考察该方法的专属性、标准曲线与定量下限、精密度与回收率、稳定性。结果血浆中游离卡马西平在0.2~50.0μg•mL-1内,线性关系良好,标准曲线为y=2.04×104x-4.61×102(r=0.9989)。游离浓度分析方法的回收率为96.86%~104.89%,绝对回收率达到98.40%~102.40%,批内、批间RSD均小于3.00%。结论本方法简便、准确,适用于血浆中卡马西平游离浓度的分析。
卡马西平为三环类抗癫痫药物,是临床治疗癫痫单纯及复杂部分性发作的首选药之一。由于卡马西平治疗窗窄,个体差异大,在临床需要进行血药浓度监测[1]。目前,多采用高效液相色谱法或酶免疫法测定卡马西平的血药浓度[2,3],进而指导临床给药,但这些方法多是测定血浆中卡马西平的总浓度。药物吸收进入血浆后,部分会与血浆蛋白结合,然而只有血浆中游离形式的药物才能真正到达作用部位产生疗效,也仅是游离形式的药物与药理作用强度密切相关[4]。卡马西平的血浆蛋白结合率约75%,有文献报道采用离心超滤法测定患者血样中卡马西平的游离浓度[5],但是目前该方法存在缺陷,可能会破坏药物蛋白结合平衡,导致测定结果不准确。本研究用中空纤维离心超滤技术,克服目前游离药物分析方法的不足,并结合超高效液相色谱法,建立人血浆中卡马西平游离浓度的测定方法,并成功用于我院临床治疗药物监测。
一、材料和方法
1、材料
药品卡马西平标准品,含量:99.7%,批号:100142-201105,购自中国食品药品检定研究院。空白血浆和临床血浆样本,均由河北医科大学第二医院提供。
仪器ACQUITY超高效液相色谱仪,美国Waters公司产品。
2、测定条件、溶液配制与样本处理
色谱条件色谱柱:WatersUPLCBEHC18柱(50.0mm×2.1mm,1.7μm),流动相:乙腈-水=35∶65,检测波长:254nm,柱温:30℃,流速:0.2mL·min-1,进样量:2μL。
溶液配制取卡马西平对照品约20mg,置于10mL量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为卡马西平储备液,其中卡马西平质量浓度为2mg·mL-1。用水逐级稀释成质量浓度分别为500,200,100,50,20,10,5和2μg·mL-1的卡马西平标准溶液。分别取上述标准溶液20μL,加入空白血浆超滤液180μL,涡旋混匀。制备质量浓度分别为50.0,20.0,10.0,5.0,2.0,1.0,0.5和0.2μg·mL-1线性标准溶液用于游离浓度分析。分别取上述标准溶液20μL,加入空白血浆180μL,涡旋混匀。制备质量浓度分别为50.0,20.0,10.0,5.0,2.0,1.0,0.5和0.2μg·mL-1线性标准溶液用于总浓度分析。同法制备质量浓度分别为0.2,2.0和40.0μg·mL-1的质控样本。
样本预处理取血浆样本0.5mL置于超滤玻璃管中,将中空纤维以U型插入到玻璃管中,以4500r·min-1离心5min,所得超滤液进行UPLC分析,计算游离浓度。向上述超滤后剩余样本中加入丙酮200μL,涡旋2min,另取中空纤维以U型插入到玻璃管中[6],重复上述离心超滤过程,所得超滤进行总浓度分析。
3、方法学考察
专属性比较空白血浆超滤液、空白血浆超滤液加标样本(2μg·mL-1)和临床服用卡马西平的患者血浆样本超滤液进行UPLC分析所得的色谱峰。
标准曲线和定量下限取“溶液配制”项下线性标准血浆溶液50.0,20.0,10.0,5.0,2.0,1.0,0.5和0.2μg·mL-1,直接进行UPLC分析,以相应的峰面积(A)对质量浓度(C)进行线性回归分析,计算卡马西平分析的标准曲线。以信噪比(S/N)为3和10,分别计算卡马西平浓度分析的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。
精密度与回收率取“溶液配制”项下低、中、高3个质量浓度(0.2,2.0和40.0μg·mL-1)的质控样本,分别进行HPLC分析,每个质量浓度重复5份,记录峰面积,按标准曲线计算真实浓度,以所得真实浓度与理论浓度的比值计算方法的回收率。在同一个分析批内,以所得峰面积计算3个质量浓度的批内精密度,在不同的3个分析批内,计算批间精密度。按“溶液配制”项下制备低、中、高3个质量浓度(0.2,2.0和40.0μg·mL-1)的质控样本,每个质量浓度5份,分别按“样品预处理”项下的方法进行处理,以中空纤维腔内溶液分析所得的峰面积与相应浓度的对照品溶液所得峰面积比值计算绝对回收率。
稳定性按“溶液配制”项下方法制备低、中、高3个质量浓度(0.2,2.0和40.0μg·mL-1)的质控样本,在室温下放置12h,用于评价室温稳定性。在-40℃下分别放置0,7和14d,用于考察冰冻稳定性。在-40℃放置24h后在室温融化,再继续-40℃放置24h,连续3个冻融循环,用于评价冻融循环稳定性。
二、结果
1、方法学评价
专属性在上述条件下,卡马西平的保留时间为2.55min,内源性物质不干扰卡马西平的测定,见图1。
标准曲线与定量下限血浆中游离卡马西平在0.2~50.0μg·mL-1内线性关系均良好,标准曲线为y=2.04×104x-4.61×102(r=0.9989);卡马西平总浓度的标准曲线为y=1.39×104x-2.82×(102r=0.9974)。LOD和LOQ分别为0.05和0.2μg·mL-1。
精密度与回收率卡马西平游离浓度和总浓度的日内标准偏差均小于5.06%,日间标准偏差均小于4.84%,绝对回收率可达91.42%~104.34%,结果见表1。
稳定性室温稳定性、冻融循环稳定性、冰冻稳定性结果显示RSD均小于5.5%。表明在室温放置12h、冻融循环3次和冰冻14d的稳定性良好。
2、方法学应用
选取我院需要进行卡马西平治疗药物监测的癫痫患者7名,常规服用卡马西平,在血药浓度达到稳态后,于次日给药前,抽取静脉血3mL,按照本方法测定游离浓度和总浓度,并计算血浆蛋白结合率。结果见表2。
三、讨论
目前,血浆中游离药物分析方法有平衡透析法、浊点萃取法。高效前沿分析法、超速离心法和离心超滤法[5,6]。平衡透析法和浊点萃取法由于加入了缓冲液而稀释样本,破坏药物与蛋白的结合平衡,使得测得结果与真实值存在偏差,并且降低分析灵敏度。虽然高效前沿分析法和超速离心法可以克服上述缺点,但是这些方法需要复杂和费时的操作以及特殊的仪器设备,因此并不适用于常规临床分析。离心超滤法操作简单,仅需一步离心,在离心力的作用下,未与血浆蛋白结合的小分子物质通过具有一定截留分子量的超滤膜,所得超滤液中药物的浓度就是样本中游离药物浓度,目前逐渐被用于生物样本中游离药物浓度分析或蛋白结合率的测定。
STEINBORN[7]用离心超滤法测定血浆中卡马西平的游离浓度,但是传统离心超滤装置得到的超滤液体积较大,而研究者并没有考虑到超滤液和样本溶液体积比(Vu/Vs)对游离药物测定准确度的影响。但是有文献报道,Vu/Vs应该控制在20%,或是小于35%,以最小的破坏药物蛋白结合平衡,对于健康的志愿者,其血液参数变化不大,Vu/Vs对方法学的影响不明显,但是临床患者血浆样本的血液参数差别较大,导致Vu/Vs的变化也较大,所以Vu/Vs对分析准确度的影响更加严重[8]。对于临床样本,血浆条件存在较大的个体差异,Vu/Vs就更加难以控制,这样会导致所得结果的准确度和精密度较差。本实验用中空纤维离心超滤技术分析人血浆中的游离卡马西平浓度,该技术与传统的离心超滤技术相比,由于其离心力和超滤膜完全平行,小分子物质可以自由通过中空纤维,中空纤维超滤膜始终浸在样本溶液中,因此在足够的离心力和离心时间下,所得超滤液的体积是固定的,所得Vu/Vs比较小,通常小于10%,且可以准确地控制,所得结果更加准确、精密。本实验所建方法简便、快速、准确,为游离卡马西平临床分析提供了可靠的分析技术。
本研究结果显示,6例患者的卡马西平血浆蛋白结合率在75%左右,与陈冰等[4]的报道一致,但是其中1名患者,其血浆蛋白结合率只有61.76%,虽然其总浓度为9.04μg·mL-1在正常治疗范围内(4~12μg·mL-1),但是其游离浓度高达3.45μg·mL-1,结合患者病情发现,患者伴有严重的肾病综合征,且也出现了一些药物不良反应,因此,建议临床医师给该患者适当减少给药剂量。综上所述,游离血药浓度监测能为临床提供更加准确的用药指导。
参考文献:
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文章来源:董维冲,李亚前,赵梦强,刘姣,李浩然,曹培,李德强,蒋晔,张志清.UPLC法测定人血浆中卡马西平的游离浓度[J].中国临床药理学杂志,2022,38(03):263-266.
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