抗Ro52抗体是干燥综合征（SS）的特异性自身抗体，发生率约为66.7%，其与口眼干燥症及淋巴瘤呈正性相关；然而抗Ro52抗体在其他自身免疫性疾病中也常有表达，如：约有30%系统性红斑狼疮（SLE）患者表达抗Ro52抗体，这一抗体与狼疮患者的皮肤光敏密切相关[1]；约有20%特发性炎症性肌病（IIM）患者表达抗Ro52抗体，并且约有14%的免疫性肌炎中可以单独检测到抗Ro52抗体[2,3]，抗Jo-1抗体阳性的肌炎患者中抗Ro52抗体同时出现的概率约为70%。与单独的抗Jo-1抗体阳性的患者相比，同时表达抗Ro52抗体和抗Jo-1抗体的患者的肌炎和关节症状更重，预后不良的肺间质纤维化和肿瘤的发生率更高[4]。

而且IgM型抗磷脂酰抗体可以降低SLE活动度及减少器官损害，IgM型抗ds-DNA抗体可以降低SLE患者肾损害的发病率，同时对狼疮鼠也具有治疗作用[5]。另外，以细胞凋亡相关抗原为靶抗原的IgM型自身抗体对SLE患者也具有保护作用，其与疾病的活动性、器官损害及心血管事件发生率呈负相关[6]。IgA、IgE和大多数IgG型自身抗体参与疾病的发病机制，其中IgA和IgE型自身抗体可能参与了狼疮性肾炎的发病及进展[7,8]；研究表明母亲抗Ro52抗体的IgG型与新生儿狼疮的房室传导阻滞密切相关[9]。所以本研究旨在研究不同抗Ro52抗体亚型与不同临床表现之间的相关性。

1、资料与方法

1.1 资料

1.1.1 样本收集

收集2015年1月至2017年10月于昆明医科大学第二附属医院风湿免疫科明确诊断为SLE/SS/IIM且抗Ro52抗体阳性的住院患者1ml血清标本和病例各50/30/30份作为实验组；及明确诊断为SLE/IIM且抗Ro52抗体阴性的住院患者病例分别50/30份，作为对照组。所有入组患者分别符合2012年国际狼疮研究临床协作组制定的SLE分类标准、2016年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟制定的pSS分类标准、2017年欧洲抗风湿病联盟/美国风湿病学会关于成人IIM的分类标准。

1.1.2 主要材料

pThioHISA由本实验室构建，大肠杆菌BL21、ER2566由本实验室保存，TRIM21基因（Cat.No:SM0331）由上海生工生物公司优化并合成。Anti-TRIM21抗体、山羊Anti-HumanIgG/A/MH&L(HRP）购自Abcam公司，KODDNA聚合酶购自ToYoBo公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶为TaKaRa公司的产品，质粒小提试剂盒云南杰美科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组pThioHISA-TRIM21质粒的构建

TRIM21全基因由生工生物工程（上海）股份有限公司优化并合成，得到含有目的基因的重组质粒pUC57-TRIM21。以质粒pUC57-TRIM21为模板，设计分别带有限制性内切酶EcoRⅠ和SacⅠ位点的上下游引物（上游：5'-TTTAACGGCACACTTGAC-3'；下游：5'-CTAGAGATGGAGAGGAGA-3'）。通过分子克隆方法将目的基因插入表达载体pThioHISA中，构建pThioHISA-TRIM21质粒。

1.2.2 重组TRIM21的表达与纯化

取-20℃保存菌液10μl于5mlLB培养基内活化，37℃恒温振荡培养8～12h。将活化的菌液加入无菌的LB培养基内，并加入氨苄青霉素；将培养基置于37℃大摇床内，180r/min振荡培养6～8h，去除少量菌液测定OD600在0.6左右时，降低温度培养。摇瓶内菌液的温度降至诱导温度时，按照1∶1000比例加入诱导剂IPTG诱导8～10h。回收菌体，8000g离心15min，去除菌液上清。超声裂解破碎菌体重悬液，分别取适量上清与沉淀进行SDS-PAGE分析及Westernblot验证。将可溶性蛋白通过不同梯度浓度尿素进行纯化和复性。

1.2.3 Westernblot验证

将重组TRIM21抗原做样，进行SDS-PAGE胶分析，待样品快跑出胶时将胶取出，浸泡在1×的电转液里面。打开电转仪器去离子水清洗干净，铺上一层大小与胶相当，使用电转液浸润的滤纸，在上面铺上一层硝酸纤维素膜，将胶平铺在膜上，最后盖上一层滤纸，保证每层膜之间没有气泡。连接电源，按照每块胶电流为35mA设定参数，时间为1h。转膜完成后，将硝酸纤维素膜取出浸泡在脱脂奶封闭液中，室温封闭2h。封闭完成后使用TNT（即在TN缓冲液中加入Tween-20至0.05%）清洗1遍，按照1∶3000稀释中和抗TRIM21单抗作为一抗，室温孵育45min。一抗孵育完成后，使用TNT清洗5遍，每遍3min。加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体作为二抗（1∶5000）室温孵育1h。酶标二抗体孵育完成后，使用TNT清洗5遍，每遍3min。清洗完成后进行化学发光显影。

1.2.4 ELISA实验

采用重组TRIM21作为抗原，使用1*CB作为包被缓冲液，包被浓度为100ng/孔，体积为100μl/孔，37℃培养箱包被2h后置于4℃冷库过夜。采用4%的明胶作为封闭液，200μl/孔，37℃封闭2h。使用20%NBS为样品稀释液，稀释100倍。将稀释好的血清100μl/孔转移至包被有抗原的KE板内，用封板膜封住，防止液体挥发及污染，并置于37℃恒温箱内孵育45min。揭掉封板膜后使用PBST清洗5遍，甩干/拍干板内残留液体。加入100μl/孔酶标二抗GAM-HRP(1∶5000），盖上封板膜37℃孵育1h。揭掉封板膜后使用PBST清洗遍，甩干/拍干板内残留液体。加入显色液（A∶B=51∶1)100μl/孔，显色15min，加入终止液50μl/孔，反应5min后，酶标仪于450nm处读取各孔OD值。

1.3 统计学分析

数据采用GraphPadPrism7统计软件进行分析。正态分布均采用表示。两组之间比较采用t检验；多组之间比较采用方差分析。计数资料采用卡方检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 TRIM21(Ro52）表达和纯化

2.1.1 TRIM21表达质粒鉴定

TRIM21，总共1440bp，大约50kD，当连接在pHisA载体上时，总共大约66kD。pThioHISA-TRIM21质粒经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切后可见大小约1440bp的目的条带，与理论的条带位置大小相同。经PCR鉴定及合成的TRIM21基因（由公司合成Puc57-TRIM21）作为对照，显示目的基因片段已经正确插入表达载体中，可进行目的蛋白的表达纯化工作（图1）。

2.1.2 TRIM21表达与鉴定

选取鉴定正确的TRIM21表达质粒进行转化ER2566菌株及BL21菌株，并挑选阳性克隆进行诱导表达，表达结果如图2所示。所挑选的克隆在66kD大小位置，相较于BL21及ER2566菌体蛋白均有明显的目的蛋白的表达，与理论分子量相当。

2.1.3 TRIM21蛋白纯化与鉴定

对蛋白大量表达时发现，在30℃及18℃两个温度下诱导表达，蛋白均是以包涵体形式存在。纯化采用不同浓度的尿素吹溶后进行梯度透析复性，即可去除大量菌体自身的蛋白。本研究采用Westernblot进行验证，结果如图3、4所示。

2.1.4 TRIM21蛋白复性及鉴定

对不同浓度尿素吹溶初步纯化并鉴定好的蛋白做梯度透析复性，并对其进行Westernblot验证，结果如图5所示。目的条带显色明显且具有明显的特异性，为接下来的间接ELISA实验做好了必需的特异性TRIM21抗原。

2.2 抗Ro52抗体亚型的ELISA检测

2.2.1 110份血清样本中（包括SLE50份、SS30份、IIM30份），抗Ro52抗体亚型IgG的水平明显高于IgM(P<0.0001）和IgA(P<0.0001）的水平；且IgM的水平也明显高于IgA的水平（P<0.0001）。见表1。

2.2.2 ①在50份SLE血清中，抗Ro52抗体亚型IgG水平高于IgM(P<0.0001）和IgA(P<0.0001）；而IgM与IgA之间差异无统计学意义（P=0.1400）。②在30份SS血清中，抗Ro52抗体亚型IgG水平高于IgM(P<0.0001）和IgA(P<0.0001）；而IgM与IgA之间差异无统计学意义（P=0.5513）。③在30份IIM血清中，抗Ro52抗体亚型IgA水平低于IgG(P=0.0002）和IgM(P<0.0001）；而IgG与IgM之间差异无统计学意义（P=0.0610）。见表1。

2.3 病例统计结果

2.3.1

①在50份被检测的抗Ro52抗体阳性的SLE患者中抗Ro52抗体阳性患者的狼疮活动度评分（systemiclupuserythematosusactivityindexes,SLE‐DAI）在IgG型与非IgG型（即IgM和IgA）中无明显差异（采用t检验，P=0.3376）。狼疮性肾炎（lupusnepphritis,LN)(P=0.5602）、血小板（platelet,PLT）降低（P=0.2520）、皮疹的发生率（P=0.5683）在IgG型与非IgG型之间差异无统计学意义；而IgG型患者关节炎的发生率低于非IgG型（P=0.0451）（采用χ2检验）。②50份抗Ro52抗体阳性与50份抗Ro52抗体阴性的SLE患者中SLEDAI评分差异无统计学意义（采用t检验，P=0.2197）。LN(P=0.8369）、PLT降低（P=0.6893）、皮疹的发生率（P>0.9999）无明显差异，而抗Ro52抗体阳性关节炎的发生率高于阴性患者（P=0.0018）（采用χ2检验）。见表2。

2.3.2

在30份被检测的抗Ro52抗体阳性的SS患者中干燥综合征疾病活动度评分（EULARprimarySjögren'ssyndromediseaseactivityindexes,ESSDAI）在IgG型与非IgG型抗Ro52抗体阳性患者之间差异无统计学意义（采用t检验，P=0.1447）。IgG升高（P=0.4189）、肺间质病变（interstitiallungdisease,ILD)(P=0.6707）的发生率在IgG型与非IgG型患者之间无明显差异（采用χ2检验）。

2.3.3

①在30份被检测的抗Ro52抗体阳性的IIM患者中肌炎活动度（myositisactivityindexes,MDI)(P=0.1703）、肌炎皮损严重指数（cutaneousderma‐tomyositisdiseaseareaandseverityindex,CDASI）（活动性）（P=0.6678）、CDASI（损伤性）（P=0.4464）在IgG型与非IgG型抗Ro52抗体患者中无明显差异（采用t检验）；而IgG型患者ILD的发生率较高（采用χ2检验，P=0.0261）。②在30份抗Ro52抗体阳性与30份抗Ro52抗体阴性IIM患者中抗Ro52抗体阳性患者MDI高于阴性患者（P=0.0077),CDASI（活动性）（P=0.0551）、CDASI（损伤性）（P=0.5408）在二者之间差异无统计学意义（采用t检验）；而抗Ro52抗体阳性患者ILD的发生率高于阴性患者（采用χ2检验，P=0.0221）。

3、讨论

本研究通过纳入110例抗Ro52抗体阳性患者血清样本（包括SLE50份、SS30份、IIM30份）及190份病历资料（包括SLERo52+/-各50份、SSRo52+30份、IIMRo52+/-各30份）。旨在研究不同临床表现与抗Ro52抗体的表达及该抗体亚型之间的相关性。在110份总样本中，抗Ro52抗体亚型IgG的水平明显高于IgM和IgA的水平（P<0.0001）；而且在50份SLE样本中，亚型IgG水平高于IgM(P<0.0001）、IgA(P<0.0001);30份SS中，亚型IgG水平高于IgM(P<0.0001）和IgA(P<0.0001);30份IIM中，亚型IgA水平低于IgG(P=0.0002）和IgM(P<0.0001）；而IgG与IgM之间差异无统计学意义（P=0.0610）。结果表明不管在总样本中还是不同病种中，抗Ro52抗体亚型都是以IgG为主。研究表明母亲抗Ro52抗体的IgG型与新生儿狼疮的房室传导阻滞密切相关[9]，该抗体IgG型主要抗Ro52蛋白的氨基酸序列200～239，而此序列正位于Ro52蛋白卷曲结构域中[10]，也许表明该结构域是Ro52蛋白的主要抗原表位。然而目前研究仅表明此结构域与Ro52蛋白细胞质定位密切相关，所以还需进一步针对该蛋白不同结构域的功能进行研究。

本研究中还有一有趣发现，即在SLE患者中抗Ro52抗体阳性关节炎的发生率高于阴性患者（P=0.0018）（采用χ2检验），且IgG型患者关节炎的发生率低于非IgG型（P=0.0451）（采用χ2检验）；有研究表明IIM患者中，关节炎的发生率与抗Ro52抗体正相关[11]。在IIM患者中抗Ro52抗体阳性患者ILD的发生率较高（采用χ2检验，P=0.0221），这与SRIV‐ASTAVA等[11]研究结果一致。且本研究还发现IgG型患者ILD的发生率高（采用χ2检验，P=0.0261）。而在SS中，ILD的发生率与抗Ro52抗体的亚型无关，且CLANCY等[12]和MIRANDA等[13]研究表明：SS患者中，ILD与抗Ro52抗体不相关；再者，本研究中SS患者中的抗Ro52抗体亚型主要是以IgG型为主。另外，本研究中抗Ro52抗体阳性SLE患者的白细胞减少发生率较阴性者高（与MENOR[14]和BROUWER等[15]研究结果一致）；抗Ro52抗体阳性IIM患者的MDI评分较阴性者高；但都与该抗体亚型没有关联。所以这些结果似乎表明抗Ro52抗体在不同疾病中具有不同的致病性，即使同一亚型（如IgG型）在不同的疾病内环境下也能导致不同临床表现；如前所述该抗体IgG型靶抗原表位主要是位于Ro52蛋白卷曲结构域中，所以不同疾病自身炎症环境和基因背景可能是导致不同临床表现的关键因素。但是至今为止，对即使在同一疾病中抗Ro52抗体的致病机制都知之甚少。

其是否是通过作用于靶蛋白Ro52而介导致病？目前为止只有体外研究显示抗Ro52抗体能够结合Ro52的RING结构域从而抑制Ro52介导的泛素化而积极地参与自身免疫疾病[16]；还是直接致病？有研究表明抗Ro52抗体能直接结合心肌细胞，导致胎儿房室结传导时间的延长，导致患儿先天性心脏传导阻滞[17]；还是通过IC形式参与致病？IC能被浆细胞样树突状细胞吞噬转位到核内体并刺激TLR7或TLR9活化，导致IFN-α的大量释放；还是与其相关多重机制共同介导？如本实验研究结果表明，相关临床表现不仅与抗Ro52抗体相关，还与该抗体的亚型有关。所以也许抗Ro52抗体不同亚型所针对不同Ro52蛋白结构域在不同疾病中所导致的致病机制也不尽相同。但由于本实验样本量有限未能统计出更多的临床表现与抗Ro52抗体亚型的相关性，故在后续研究中加大样本量至关重要，这样才能继续深入研究该抗体的亚型与更多的临床表现及实验室指标之间的相关性，使其亚型成为临床预测的重要指标，从而为该抗体致病性的基础研究做好铺垫。

参考文献:

[4]宋国情,王永福,刘媛结晦组织病系统受累与自身抗体之间的关系[J].中国免疫学杂志,2019,35(19).2430-2433.

[5]郭林杰,蔡﹐.SLE患者IgG4型抗核抗体的检测及其临床意义[J].广东医学院学报,2016,34(5)12-14.DO110.3969/.issn.1005-4057.2016.03.0Q22.

文章来源：赵国旺,齐家龙,付萍.不同抗Ro52抗体亚型与SLE/SS/IIM患者临床表现的相关性研究[J].中国免疫学杂志,2021,37(23):2900-2905.