摘要:目的探讨单磷酸脂质A(MPLA)佐剂对无细胞百日咳疫苗(aP)的免疫保护效果影响。方法aP中添加MPLA佐剂,在Balb/c小鼠上进行免疫以及感染保护实验。通过检测小鼠百日咳特异性IgG抗体及其分型抗体IgG1和IgG2a水平、感染后白细胞变化以及气管和肺组织细菌定植来进行免疫效果的评估。结果aP+MPLA免疫的小鼠在第一次和第二次免疫后所产生的IgG抗体水平均高于aP组,且两次基础免疫后显著促进了Th1细胞免疫。但百日咳气雾感染保护实验结果显示无论是否添加MPLA,疫苗在小鼠上都具有明显的保护效果。但添加MPLA佐剂,对小鼠感染后白细胞变化以及气管和肺组织细菌定植并未有显著改善。结论MPLA佐剂对aP的免疫保护效果并未有明显改善。
百日咳是由革兰氏阴性鲍特氏杆菌(B.p)引起的急性呼吸道感染性疾病。百日咳杆菌可在各年龄组的人群中引起较高的发病率,而且可对未接种疫苗的婴儿形成生命威胁[1]。全菌体的百日咳疫苗(wP)于20世纪30年代成功研制后,在40年代得到了大规模的应用。但是因为wP伴随着很多严重的副反应,如伴有或不伴有发热性痉挛、肿胀、疼痛以及注射部位红肿甚至高热、惊厥以及脑病等[2]。
为了减少这些副反应的发生率和程度,Sato等[3]设计了一种用共纯化方式获得的无细胞百日咳疫苗(aP)。含百日咳杆菌1~5个组分的aP上市后便广泛替代wP使用至今[4]。虽然疫苗是预防此疾病最有效的工具,但并不是100%的有效[5]。即使在疫苗覆盖率超过90%的国家,每年感染率仍达到1%~7%[2,6,7]。全球百日咳发病率的增加可能反映了检测方法学灵敏度的提高、疫苗诱导的保护力以及诱导的保护时间的有限以及病原体的适应和进化[8,9,10,11]。其中一个很重要的因素可能是目前使用的aP无法在基础免疫后诱导强效的细胞免疫,而强效的细胞免疫是疫苗介导长期保护的必要条件[12]。
有研究表明,TLR4配体LPS的存在是wP诱导的免疫反应更偏向于Th1反应的一个重要因素[13]。在aP中加入TLR4配体作为佐剂能诱导更理想的细胞免疫反应[13,14]。无毒性的单磷酸脂质A(MPLA)来源于沙门氏菌的脂多糖。一些临床前研究显示,MPLA可以诱导IL-2和IFN-γ的合成和释放,从而促进了Th1细胞反应的产生[15,16]。本研究拟利用实验室前期建立的百日咳气雾攻击动物模型开展用常规的aP[含百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、黏附素(PRN)以及铝佐剂)]作为基础疫苗,研究加入MPLA佐剂后对aP的免疫效果影响。通过动物实验研究试验疫苗在动物体中介导的免疫反应差异,特别是Th1和Th2的差异,评价MPLA佐剂的添加对改善aP的免疫效果,从而为后续新型的疫苗研发奠定基础。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 疫苗
无细胞百日咳疫苗的三个抗原组分PT、FHA和PRN由中国医学科学院医学生物学研究所自主制备;MPLA购自美国Avanti公司;PT、FHA、PRN及MPLA分别用氢氧化铝佐剂吸附制成原液,按所需的量加入。各疫苗配方见表1。
1.1.2 试剂
百日咳攻击菌(菌株号:B.p2016-CY-41)由中国食品药品检定研究院提供,为近期从临床病人新分离的流行株;对百日咳毒素启动子(ptxP)、百日咳毒素亚单位1(ptxA)、PRN、百日咳菌毛蛋白(Fim)2和Fim3的多态性进行测序分析,百日咳菌株B.p2016-CY-41基因型为ptxP1/ptxA1/prn1/fim2-1/fim3-1;百日咳抗血清标准品(含5种百日咳抗原的抗体组分:anti-PT17IU/ml、anti-FHA143IU/ml、anti-PRN30IU/ml、anti-Fim232IU/ml、anti-Fim332IU/ml)购自英国国家生物制品检定所;羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a二抗(带HRP)购自美国Jackson公司;包被抗原PT、FHA和PRN为我所保存;单组分TMB底物显色液购自北京索莱宝科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 实验动物
SPF级Balb/c小鼠,4~5周龄,共60只,雌雄各半,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0006。所有动物实验均根据中国医学科学院医学生物学研究所动物保护和使用委员会批准的方案进行。
1.2 方法
1.2.1 动物免疫及感染
将小鼠随机分为3组(aP组、aP+MPLA组和PBS对照组),每组20只,雌雄各半。每只小鼠经腹腔途径免疫两次1/40的人用剂量疫苗(0.5ml/剂),每次间隔3周。第一次免疫前三天及每次免疫后的第21天采血,分离血清,–80℃储存。在最后一次免疫的三周后对各组小鼠用百日咳鲍特氏菌菌株2016-CY-41进行气雾攻击,进行呼吸道感染(1011CFU/ml)。于感染后第2、6、10、14和21天取样,每次4只/组,对肺部、气管细菌进行计数。
1.2.2 百日咳抗体效价检测
采用ELISA法检测血清中抗PT、FHA和PRN抗体(anti-PT、anti-FHA、anti-PRN)IgG的水平。利用四参数拟合法绘制曲线,并与每个酶标板上的百日咳抗血清标准品进行比较,将抗体浓度转化为IU/ml[17]。同时分别使用IgG1与IgG2a酶二抗测定小鼠血清中IgG1与IgG2a抗体亚型的滴度,并计算两者比值;显色液TMB37℃孵育显色15min后,用OD450酶标仪检测吸光值,同时设定阴性血清对照孔,读数值/阴性值≥2.1判定为阳性孔。
1.2.3 感染后白细胞计数
气雾感染各组小鼠,于感染前、感染后第2、6、10、14、21天尾静脉采血,采全血200μl,EDTA抗凝,血球计数仪检测白细胞数。
1.2.4 感染肺部、气管菌落计数
每组每个采样点随机数字表法挑选4只小鼠,分离肺和气管组织,称取0.1g肺组织以及整个气管组织,分别加入1ml等渗无菌PBS,电动组织匀浆器研匀。适当稀释后,取50μl均匀涂布于直径为6cm的含头孢氨苄(40μg/ml)的木炭琼脂平板上,37℃孵育4~5d后计算菌落克隆形成数(CFU)。剩余肺组织全部制备成匀浆,并加入PMSF,–80℃冻存,以检测细胞因子含量。
1.3 统计学处理
采用Graphpadprism软件进行数据分析并绘图。两组间的比较采用双尾t检验,三组间比较采用One-wayANOVA分析,以P<0.05表示差异有统计学意义。
2、结果
2.1 免疫后抗原特异性IgG抗体应答
第一次免疫后的第21天,aP组小鼠血清中的anti-PT、anti-FHA以及anti-PRN的IgG抗体平均水平分别为47.16、38.25和12.82IU/ml;aP+MPLA组的PT、FHA以及PRN的特异性IgG水平均高于aP组,分别为88.12、95.88和94.76IU/ml(图1A~C)。第二次免疫后的第21天,aP组小鼠血清中的anti-PT、anti-FHA以及anti-PRN的IgG抗体水平与第一次免疫后相比,有了明显升高,分别为731.25、770.95和552.18IU/ml;但aP+MPLA组第二次免疫后血清anti-PT、FHA以及PRN的特异性IgG水平与aP组相比,仍高于aP组且具有统计学差异,分别为1200.12、3475.81和3369.76IU/ml(图1D~F)。
2.2 IgG1与IgG2a变化
在第二次免疫后检测血清中IgG抗体的同时,还检测了IgG1和IgG2a亚型的抗体滴度,以此作为CD4+T细胞应答的间接测量指标。MPLA佐剂所诱导的anti-PT、anti-FHA以及anti-PRN的不同IgG亚型(IgG1、IgG2a)抗体水平均高于aP组(图2A~C)。计算各抗体IgG2a与IgG1的比值,发现免疫aP+MPLA的小鼠anti-PT、anti-FHA以及anti-PRN的IgG2a与IgG1的比值均高于免疫aP的小鼠(图2D),说明MPLA佐剂可促进无细胞百日咳疫苗产生偏向性Th1细胞免疫反应。
2.3 小鼠气雾感染后白细胞变化
百日咳杆菌气雾攻击小鼠后第2天,PBS对照组小鼠白细胞数(WBC)与感染前相比出现了显著性升高,并在第14天达到峰值,在第21天恢复至正常水平。aP组和aP+MPLA组小鼠的WBC水平在感染后第2、6和10天与感染前相比无显著性变化,而在感染后第14天时,两组小鼠的WBC均有一过性升高,第21天便恢复至正常水平(图3)。
2.4 小鼠气雾感染后气管和肺组织细菌定植分析
对照组小鼠感染后百日咳杆菌在肺组织大量定植,并且在感染后的第10天达到最高峰(2.3×105CFU/ml),且在感染后的第21天仍未清除(图4A)。与对照组小鼠相比,两组疫苗接种组小鼠在肺组织中的细菌定植显著降低,但仍有少量定植,且两组之间无显著性差异。到感染后第21天,免疫aP+MPLA小鼠的肺组织已将感染清除至检测限,而aP免疫的小鼠肺组织中仍检测到少量细菌定植。此外,在气管组织中的细菌定植与肺部相似,各疫苗接种组的小鼠在气管中的细菌定植数量与对照组相比显著降低。其中aP+MPLA免疫的小鼠和aP组一样在感染第14天就将气管组织细菌定植清除至检测限(图4B)。
2.5 小鼠气雾感染后血清和肺组织中细胞因子分析
实验中我们观察到感染后的第2、6和10天,各组小鼠血清中IFN-γ水平没有明显差异(图5A);而免疫aP的小鼠血清中,与Th2反应相关的IL-5细胞因子水平在感染后的第2天显著高于其他组(图5B);此外,感染后对照组小鼠血清中与Th17细胞反应相关的IL-17A的水平显著高于两种疫苗组(图5C),这说明小鼠的百日咳自然感染可以引起很强的Th17反应。同时,我们还检测了小鼠肺匀浆中的细胞因子以作为肺局部免疫指标,同血清中反应一样,各组小鼠肺组织中IFN-γ水平没有明显差异(图5D);而免疫aP的小鼠肺组织中,与Th2反应相关的IL-5细胞因子水平在感染后的第2天显著高于其他组(图5E),在感染后的第6天,疫苗组小鼠IL-5细胞因子水平均高于对照组(图5E);感染后第10天对照组小鼠肺组织中IL-17A的水平显著高于两种疫苗组(图5F)。
3、讨论
尽管自20世纪30年代以来就已经有百日咳预防性疫苗,但最近的流行病学数据表明百日咳的预防控制仍然存在问题[1,18]。MPLA为TLR4的配体,可显著增强T细胞和B细胞的免疫应答,将MPLA作为佐剂已经在很多疫苗都被证实具有免疫增强的效应。近年来的研究还显示将TLR4配体作为佐剂添加到aP中可提高百日咳特异性CD4+T细胞应答[13]。因此,在此研究中我们将MPLA作为新的佐剂加入aP中,对其进行免疫刺激作用的评价。
我们的研究发现,与单一使用铝佐剂相比,添加MPLA可同时显著提高aP免疫的IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平,且显著提高了小鼠的Th1细胞免疫。此外,在使用百日咳杆菌菌株号为2016-CY-41的流行株作为攻击菌株的小鼠中,1/40人用剂量的aP是具有保护性的,并且在该剂量下,添加MPLA佐剂在一定程度上可加快小鼠肺部细菌的清除,反映在感染后第14天肺部细菌就已经清除,而aP疫苗组在感染后第21天还检测到少量细菌。但添加MPLA的疫苗组小鼠感染后的白细胞水平,与aP相比没有显著性差异。另外,MPLA的加入对气管的细菌定植未观察到明显改善。在此研究中,MPLA的加入并未达到理想的改善aP的保护效果。
对于这种现象我们主要有以下三点考虑,第一,MPLA可能在细胞免疫记忆的迅速激活方面没有起到明显的促进作用,这反映在小鼠感染后血清和肺组织中IFN-γ水平都没有观察到显著变化;Auderset等[19]研究表明,相比于TLR4的激动剂,TLR9的激动剂可诱导更高更快的免疫记忆细胞激活。第二,MPLA的加入可能没有显著提高Th17细胞的作用。已有大量的研究表明,Th17细胞在百日咳免疫保护效果中具有非常重要的作用[20]。很遗憾在此研究中我们并没有监测MPLA的加入对小鼠免疫后Th17细胞的促进作用,只是将此作为一种推测。第三,百日咳自然感染可诱导保护性的黏膜免疫,这在再次感染的细菌快速清除中起到重要作用[21]。此外,有研究表明细菌自然感染后在组织中诱导的局部组织驻留记忆T细胞(TRMs)在抵抗再次感染中起关键作用[22],而腹腔免疫途径不能诱导较好的黏膜免疫[23]。
本研究的结果表明,MPLA作为免疫佐剂添加到无细胞百日咳疫苗中与未添加MPLA的疫苗相比较都能产生足够的免疫保护能力。百日咳感染后保护效果的主要指标是检测白细胞和动物肺部百日咳菌克隆数的变化[24],以及感染后细菌定植清除的效率。百日咳杆菌气雾攻击小鼠后,保护效果较好的疫苗组即白细胞上升更少、细菌定植量更少。MPLA的加入虽然可显著提高小鼠免疫后的体液和细胞免疫水平,但MPLA的添加与否并不影响疫苗的保护性能。与对照组小鼠相比,两组疫苗接种组小鼠感染后外周血白细胞数量在10天内无显著性变化,在肺组织和气管组织中的细菌定植显著降低且细菌清除时间相同,两组之间无显著性差异,因此两组疫苗在保护效果上并无明显差别。分析结果我们认为向当前aP中添加MPLA并不是改善aP的最佳方式,后续的研究应该考虑其他佐剂以及其他免疫途径。
参考文献:
[17]江文文,梁疆莉,高娜,等.候选无细胞百白破-Sabin株灭活脊髓灰质炎联合疫苗免疫小鼠的效果研究[J].中国疫苗和免疫.2018,24(5).559-564.
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文章来源:王虓宇,江文文,胡文著,杭赛虎,赵宏,陈溢娟,赵云蓉,柏会文,赵宸,梁疆莉.单磷酸脂质A佐剂对无细胞百日咳疫苗的免疫保护效果研究[J].中国医药生物技术,2022,17(01):12-18.
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