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Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠干预效果及作用机制

2021-03-12 137 上传者：管理员

摘要：目的研究Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠的干预效果及作用机制。方法选取30只清洁级SD雄性大鼠,10只为正常组,其余20只建立脑梗死模型,成功18只,随机分为模型组、Wnt3a溶剂组,各9只。Wnt3a溶剂组大鼠给予50ng/mlWnt3a重组蛋白腹腔缓慢注射6μl,正常组和模型组给予等体积的生理盐水,三组连续干预1w。检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β水平,评估神经功能,观察脑组织病理学及脑梗死体积,检测Wnt3a、β-catenin蛋白。结果与正常组相比,模型组、Wnt3a溶剂组SOD、GSH、神经功能评分降低,MDA、TNF-α、IL-1β水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,Wnt3a溶剂组SOD、GSH水平升高,MDA、TNF-α、IL-1β水平降低,脑梗死体积减小,神经功能评分升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组相比,模型组、Wnt3a溶剂组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,Wnt3a溶剂组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠干预效果显著,能抑制其氧化应激、炎症反应,减少脑梗死体积,提高神经功能,其作用机制可能与Wnt3a/β-catenin信号通路有关。

关键词：
Wnt3a蛋白
Wnt信号通路
作用机制
神经功能
脑梗死
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脑梗死是临床中常见的一种脑血管疾病,具有较高的发病率、死亡率及致残率,对人们的身体健康和心理产生严重的危害[1],已经成为全球研究的重中之重。目前在临床中治疗脑梗死主要采用溶栓治疗,神经影像学检查等,但是大部分患者神经功能恢复的效果均不显著[2]。Dong等[3]研究认为,脑梗死后机体缺血区域神经细胞也会紧跟着发生坏死,周围神经细胞表现为延迟性神经元退变。Wnt信号通路属于一种生长刺激信号通路,其启动信号主要是Wnt蛋白,主要存在于脑组织、海马区等中枢神经系统中,发挥着关键性的作用[4]。目前已经有研究证实,Wnt3a蛋白参与脊髓发育过程[5],在脑梗死中作用相关研究较少。本文旨在研究Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠的干预效果及作用机制,为其临床应用提供理论依据。

1、材料与方法

1.1材料

选取30只清洁级SD雄性大鼠,体重240～320g,均由河北伊维沃生物科技有限公司提供,许可证号:SYXK(冀)2019-008。均在室温22℃、湿度50%环境下饲养,自由饮食和饮水。

1.2实验方法

1.2.1脑梗死模型建立及分组

30只大鼠中选取10只为正常组,其余20只参考田烜[6]建立脑梗死模型,具体操作:采用4%的异氟烷将大鼠吸入麻醉后,保证其进行自主呼吸。选择大鼠颈部正中切口,将右侧的颈总、外、内动脉分别分离后,将颈总、外动脉进行结扎,在近分叉位置做一“V”形切口,使用多聚赖氨酸、明胶等处理的1.8号鱼线从切口位置向大鼠右颈内动脉插入,深度为18.5mm,一直到大鼠大脑中的动脉位置,将血供完全阻止。模型成功标准即大鼠右侧出现霍纳综合征(Horner征),成功18只,随机分为模型组、Wnt3a溶剂组,各9只。

1.2.2药物干预

Wnt3a溶剂组大鼠给予50ng/mlWnt3a重组蛋白腹腔缓慢注射6μl,正常组和模型组给予等体积的生理盐水进行干预。三组大鼠均连续干预1w。

1.2.3氧化应激、炎症指标检测

抽取大鼠腹部静脉血3ml,以3000r/min离心速度,离心处理10min,分离上层血清。采用硫代巴比妥酸检测丙二醛(MDA)水平;采用黄嘌呤氧化酶反应检测超氧化物歧化酶(SOD)水平;采用比色法检测谷胱甘肽(GSH)水平。采用酶联免疫吸附试验检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β水平:将提前稀释好的标准品100μl加入相应的微孔板反应空中,第1孔只加样品稀释液为零孔。盖上模板混合均匀,在37℃下处理90min,甩去孔内液体,吸干水分;将准备好的抗体(0.1ml)加入到每孔中,在37℃下处理60min,底物中加四甲基联苯胺(TMS),空白孔中不加;甩去孔内液体,每孔中加满0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS),浸泡1～2min,甩去孔内液体,吸干水分;每孔中加入90μlTMS,避光处理15～20min;每孔中加入90μlTMS终止液,即蓝色变为黄色。在波长450mm处分析TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4神经功能统计

大鼠神经功能采用Garcia评分[7]来完成,得分3～18分,12～18分表示大鼠有轻度神经功能损伤;8～11分表示大鼠有中度神经功能损伤;3～7分表示大鼠有重度神经功能损伤。

1.2.5脑组织病理学观察及脑梗死体积统计

处死大鼠,快速提取大鼠脑组织制作标本,将其置于4%的多聚甲醛中进行固定,制作常规石蜡切片,在浓度0.5%苏木素-伊红染色10min,自来水冲洗1次;使用乙醇梯度进行脱水处理,最后用中性树胶进行封片。大鼠脑梗死体积=脑梗死面积×切片厚度。

1.2.6Wnt3a、β-catenin蛋白检测

采用Western印迹检测,将采集到的血液标本10000r/min离心处理10min,对上清液进行提取后,BCA进行蛋白定量检测,在2×十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶缓冲液中加入50μg蛋白,在100℃环境中加热5min有助于蛋白发生变性。凝胶电泳完、转膜,取膜,4℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间为1h,将一抗使用0.05%～0.10%TBST给予稀释(Wnt3a、β-catenin一抗为1∶1000),4℃孵育过夜保存,之后使用0.05%～0.10%TBST洗膜,3次,每次为5min,二抗被0.05%～0.10%TBST稀释(1∶10000),摇动孵育时间为1h,再次采用TBST连续洗膜3次,处理时间为5min。二氨基联苯胺(DAB)显色,定量分析蛋白表达情况。以GAPDH为内参。

1.3统计学处理

采用SPSS20.0软件行方差分析、t检验。

2、结果

2.1各组氧化应激相关指标比较

与正常组相比,模型组、Wnt3a溶剂组SOD、GSH水平降低,MDA水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,Wnt3a溶剂组SOD、GSH水平升高,MDA水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1各组氧化应激相关指标比较

2.2各组炎症因子TNF-α、IL-1β水平比较

与正常组相比,模型组、Wnt3a溶剂组TNF-α、IL-1β水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,Wnt3a溶剂组TNF-α、IL-1β水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3各组脑梗死体积、神经功能比较

与正常组相比,模型组、Wnt3a溶剂组神经功能评分降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,Wnt3a溶剂组脑梗死体积减小、神经功能评分升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2各组炎症因子TNF-α、IL-1β水平比较

2.4各组脑组织病理学观察

如图1所示,正常组脑组织神经元、神经胶质细胞结构正常,排列整齐,无肿胀,细胞与血管之间排列紧密;模型组大鼠脑组织中神经细胞数量减少,神经元及神经胶质细胞发生肿胀,细胞与周围血管之间的空隙增大;Wnt3a溶剂组大鼠脑组织水肿明显减轻,神经细胞数量增多。

表3各组大鼠脑梗死体积、神经功能比较

图1各组脑组织病理学观察

2.5各组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量比较

与正常组相比,模型组、Wnt3a溶剂组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,Wnt3a溶剂组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图2。

表4各组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量比较

图2各组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量比较

3、讨论

研究显示,大部分脑梗死患者梗死灶主要分布在大脑半球中某一区域,其中大脑中动脉是常见的梗死部位[8]。郭安利等[9]研究认为,氧化应激反应是导致缺血性脑血管疾病发病的主要原因。脑梗死发生会产生大量的氧自由基,氧化应激反应也随之增加,通过对其进行诱导引起神经毒性损伤,导致大量神经元死亡[10,11]。SOD属于一种特异性酶对氧自由基具有一定的清除作用,常被用来作为清除自由基的标志物[12]。MDA主要通过细胞膜脂质过氧化产生,是一种稳定的代谢产物;GSH与SOD结合在细胞抗氧化中发挥着关键性的作用。本研究结果显示,Wnt3a重组蛋白溶剂能抑制脑梗死模型大鼠氧化应激反应,从而控制其疾病进一步发展。

Wnt信号通路参与多种器官及神经系统形成、构建过程,与神经组织中神经前体细胞的分化、增殖、迁移有紧密的联系[13]。曾毅等[14]研究指出,在脑卒中发病后Wnt3a信号通路中相关蛋白β-catenin表达上调,提示通过抑制Wnt3a信号通路导致急性脑损伤患者病情加重。脑梗死发病与炎症反应有关,一旦发生脑缺血机体产生大量的炎症反应,氧自由基、兴奋性氨基酸被大量释放,放出有毒物质,对脑组织带来不可逆的损伤,神经细胞大量凋亡,脑损伤严重程度较重[15]。TNF-α属于一种重要的炎症反应因子,参与动脉粥样硬化形成过程,加快脑神经细胞凋亡速度。IL-1β能将内皮细胞激活,血栓产生,诱导细胞间黏附分子表达异常,促进中性粒细胞向大脑组织浸润,引起炎症反应,同时也是脑缺血损伤发病的主要病理原因[16]。本研究结果发现,Wnt3a重组蛋白溶剂能抑制脑梗死模型大鼠炎症反应发生,减少对脑组织带来的损伤。在临床脑梗死患者中,大脑中动脉阻塞发病率较高,其优势是不需要进行开颅,并且梗死部位较为恒定,具有良好的重复性和稳定性,这一模型的发病与患者临床发病有相似之处[17]。本研究结果证实,Wnt3a重组蛋白溶剂能减少脑梗死模型大鼠脑梗死体积,提高神经功能,促进其恢复。

Wnt3a蛋白与其他Wnt蛋白特点有相似之处,其特点主要体现在疏水性,以自分泌和旁分泌方式向细胞外进行释放,可以结合细胞表面受体,将下游的信号相关通路激活[18,19]。Wnt3a信号蛋白在神经干细胞向神经元分化过程中发挥着重要作用,促进胚胎干细胞向脊髓背侧中间神经元转化,将Wnt信号通路激活后对神经胶质细胞产生起到一定的抑制作用[20,21]。本研究中,Wnt3a重组蛋白溶剂能调控Wnt3a、β-catenin蛋白,将Wnt3a/β-catenin信号通路激活。本研究证实,Wnt3a/β-catenin信号通路激活会抑制氧化应激、炎症反应相关指标,Wnt3a重组蛋白溶剂抑制脑梗死病情发展,促进神经功能恢复与Wnt3a信号通路激活有关。

综上所述,Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠干预效果显著,能抑制氧化应激、炎症反应,减少脑梗死体积,提高神经功能,其作用机制可能与Wnt3a/β-catenin信号通路有关,为其临床应用提供理论依据。

参考文献：

[1]叶建宇,孙自玉,胡薇薇.星形胶质细胞在脑梗死中的作用及相关治疗策略[J].浙江大学学报(医学版),2018;47(5):493-8.

[4]李艳萍,杨文雪,夏启胜,等.补肾强督方对骨髓间充质干细胞成骨过程Wnt通路中因子表达的影响[J].中日友好医院学报,2019;33(2):82-7,封2.

[5]黄先甲,钱军,张坤坤,等.振荡电场对大鼠损伤脊髓组织中Wnt-3a表达及运动能力的影响[J].中国组织工程研究,2016;20(18):2648-54.

[6]田烜.高压氧干预脑梗死模型大鼠脑水肿及神经功能变化[J].中国组织工程研究,2015;19(40):6423-8.

[7]乔琳,胡彬,常明则,等.两种神经功能评分评价大鼠局灶性脑缺血模型的初步研究[J].山西医科大学学报,2012;43(12):893-5,973.

[8]李青云,江功远,戴维龙,等.T2FLAIR大脑中动脉高信号血管征在急性期和亚急性期脑梗死的诊断价值[J].中国CT和MRI杂志,2020;18(7):11-3.

[9]郭安利,付昌碧,杨晓晴,等.急性脑梗死患者肺部感染对氧化应激与炎性应激的影响[J].昆明医科大学学报,2019;40(12):97-102.

[10]宋宁,马培梁,王永兰.银杏叶提取物制剂对脑梗死缺血再灌注大鼠氧化应激反应及凋亡因子调节作用[J].临床和实验医学杂志,2019;18(21):2244-8.

[11]卞鑫,卢丽波,朱晔,等.血管紧张素转化酶抑制剂对脑梗死大鼠认知功能及脑组织细胞凋亡､氧化应激的影响[J].海南医学院学报,2019;25(21):1617-20,1627.

[12]肖兴军,苏文娜,李利,等.NGB､SOD及MDA对TIA预后意义[J].脑与神经疾病杂志,2020;38(3):181-4.