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激肽释放酶-10在甲状腺乳头状癌进展中的作用和调节机制

2024-08-28 222 上传者：管理员

摘要：目的探究激肽释放酶-10(KLK10)在甲状腺乳头状癌(PTC)进展中的作用和调节机制。方法实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测PTC患者组织和细胞系中KLK10表达水平。通过CCK-8和Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒分别检测细胞活力和凋亡率。此外，测定各组细胞葡萄糖消耗、乳酸产生和ATP浓度。蛋白免疫印迹检测FAK/SRC/PI3K/AKT轴相关蛋白表达。结果与正常组相比，PTC组织和细胞中KLK10 mRNA和蛋白水平增加，具有显著性差异(P<0.01)。沉默KLK10细胞活力较对照组减弱，而细胞凋亡较对照组增强。同时，与si-NC组相比，si-KLK10组葡萄糖消耗、乳酸产生和ATP浓度均减少，具有显著性差异(P<0.01)。而KLK10过表达组的结果与沉默KLK10组相反。此外，与对照组相比，KLK10过表达组FAK、SRC、PI3K和AKT的磷酸化水平增加。结论 KLK10通过FAK/SRC/PI3K/AKT轴调节甲状腺乳头状癌患者葡萄糖代谢和恶性进展。

关键词：
TC
内分泌恶性肿瘤
激肽释放酶-10
甲状腺乳头状癌
葡萄糖代谢
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甲状腺癌(thyroid cancer, TC)是一种常见的内分泌恶性肿瘤，其发病率在世界范围内呈上升趋势[1]。根据组织学特征，甲状腺癌可分为五种类型，其中，约80%以上的TC患者属于甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)[2]。大多数早期患者经过标准手术治疗和放射性碘治疗后，5年生存率超过90%[3]。然而，约30%的患者由于肿瘤快速生长和远处转移，出现复发或者死亡[4]。因此，了解PTC进展的具体分子机制对其诊断和治疗具有重要的意义。

激肽释放酶-10(KLK10),也被称为正常上皮细胞特异性-1(NES1),是人类激肽释放酶家族的一员[5]。KLK10编码含276个氨基酸的31 kDa分泌丝氨酸蛋白酶，在多种组织和器官中表达。此外，KLK10在组织中发挥多种生理功能，并参与癌症进展[6]。近年来，研究表明KLK10在乳腺癌[7]和前列腺癌[8]中下调，被认为是一种肿瘤抑制因子。相反，KLK10在其他几种癌症中过表达，作为肿瘤启动子发挥作用[9-10]。然而，KLK10在甲状腺癌中的作用和调节机制还不清楚。Sun等基于微阵列和生物信息学分析，认为KLK10在甲状腺乳头状癌中上调[11]。因此，本研究通过GEPIA数据库及实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹分析检测KLK10在PTC组织和细胞系中的表达，之后通过功能缺失和获得性实验进一步通过探究KLK10在甲状腺乳头状癌进展中的作用和机制。

1、材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 组织样本

本研究所用30例PTC患者(年龄：42±6.84岁，男∶女=9∶21)的肿瘤组织和癌旁正常组织(取自距离肿瘤组织5 cm以外的正常组织)从空军军医大学第二附属医院收集。所有受试者术前均经病理学检查确定为PTC,且均未接受化疗或者放疗。本研究根据《赫尔辛基宣言》进行，并得到了空军军医大学第二附属医院伦理委员会的批准。所有患者均签署了书面知情同意书。

1.1.2 细胞及主要试剂和仪器

人甲状腺正常细胞系(Nthy-ori3-1)和PTC细胞系(BHT101,TPC-1,IHH-4,KTC-1和8505C)均购自美国模式培养物集存库(ATCC);DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；TRIzol RNA提取试剂和Lipofectamine 3000脂质体转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；siRNA-KLK10和pc-DNA3.1-KLK10质粒均购自上海吉玛基因公司；反转录试剂盒和SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ购自日本Takara公司；所有引物均由上海生工生物技术公司合成；所有抗体均购自美国Abcam公司；ECL液购自美国Millipore公司；CCK-8细胞增殖试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)试剂盒、RIPA缓冲液、膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)细胞凋亡试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；CO2细胞培养箱购自美国Thermo公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司；流式细胞仪购自美国BD公司；葡萄糖摄取比色检测试剂盒、乳酸检测试剂盒和ATP比色检测试剂盒均购自BioVision公司；FAK磷酸化抑制剂(PF562711)和SRC磷酸化抑制剂(Dasatinib)购自中国Selleck公司；PI3K抑制剂(LY294002)购自MCE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 GEPIA在线软件分析

利用GPEIA在线软件(http: //gepia2.cancer-pku.cn/#index)分析KLK10在甲状腺癌中的表达，以及与GLUT1,HK2蛋白的相关性。其数据主要来源于TCGA和GTEx数据库。

1.2.2 细胞系培养和转染

人正常甲状腺细胞系(Nthy-ori3-1)和PTC细胞系(BHT101,TPC-1,IHH-4,KTC-1和8505C)分别在含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃和5% CO2的细胞培养箱中培养。

分别将TPC-1和KTC-1细胞(1×105)在24孔板中培养24 h。使用Lipofectamine 3000试剂将si-NC,si-KLK10,pc-NC和pc-KLK10转染48 h。未转染的细胞作为Control组，转染siRNA和pcDNA3.1空质粒的细胞分别为si-NC和pc-NC组，转染siRNA-KLK10和pcDNA3.1-KLK10的细胞分别为si-KLK10和pc-KLK10组。将转染pcDNA3.1-KLK10(pc-KLK10)的细胞分为四组，其他三组分别用1 μM PF562711、50 nM Dasatinib和50 Μm LY294002处理。

1.2.3 实时荧光定量PCR(Real Time quantitative PCR,RT-qPCR)

用TRIzol试剂从组织或细胞中提取总RNA,用反转录试剂盒反转录形成cDNA。RT-qPCR反应采用SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行。GAPDH作为内参，按照2-ΔΔCt方法分析各基因的相对表达水平。

1.2.4 蛋白免疫印迹(Western blotting)

用RIPA缓冲液各组组织或细胞总蛋白，然后用BCA试剂盒检测蛋白浓度。各组取等量的蛋白用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。洗膜后将PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST工作液室温培养1 h, 加入一抗孵育过夜。次日洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，并在37 ℃培养1 h。最后用ECL液进行化学发光检测，并用ImageJ软件计算灰度值。

1.2.5 CCK-8分析

将TPC-1细胞和KTC-1细胞(2×103细胞/孔)接种到96孔板培养24 h。分别于转染后0、24、48、72 h收集细胞，用CCK-8试剂盒评估细胞增殖。

1.2.6 细胞凋亡分析

收集转染后的细胞(1×106细胞/孔)分别加入细胞悬液100 μl。随后，各组加入Annexin-V TITC和PI各5 μl, 混合均匀后于黑暗中静置15 min, 用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

1.2.7 葡萄糖消耗、乳酸产生及ATP浓度检测

将TPC-1细胞和KTC-1细胞(5×104细胞/孔)接种到24孔板中48 h, 转染48 h后收集细胞上清液。分别用葡萄糖摄取比色检测试剂盒、乳酸检测试剂盒检和ATP比色检测试剂盒测上清液中的葡萄糖消耗、乳酸产生和ATP水平。

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism 8软件对至少三个独立实验的数据进行分析，结果用平均数±标准差表示。采用Shapiro-Wilk正态检验评价数据的正态性，用Student's t-test比较两组间的差异。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 甲状腺乳头状癌中KLK10表达水平

通过GEPIA检测KLK10在TCGA数据库中的表达水平结果显示，与正常组织相比，甲状腺癌组织中KLK20表达水平增加(图1A),并且在甲状腺癌不同病理阶段的表达具有差异性(图1B)。为了进一步验证KLK10在PTC中的表达水平，检测了KLK10在PTC组织和细胞系中的表达。由图1C和1D看出，与癌旁正常组织比较，PTC组织中KLK10的mRNA和蛋白表达水平均显著提高(P<0.01)。此外，在转录和翻译水平，PTC细胞系(BHT101,TPC-1,IHH-4,KTC-1和8505C)中KLK10表达水平均高于人正常甲状腺细胞(Nthy-ori3-1)中的表达水平，具有显著性差异(图1E和1F,P<0.01)。

图1 KLK10在甲状腺乳头状癌中的表达

2.2 KLK10沉默和过表达对PTC细胞活力和凋亡的影响

如图1E和1F所示，KLK10的相对表达水平在TPC-1细胞系中较高，在KTC-1细胞系中较低。因此，选择TPC-1细胞系对KLK10进行沉默，选择KTC-1细胞系对KLK10进行过表达。从图2A和2C可以看出，转染si-KLK10后，TPC-1细胞中KLK10表达水平显著下降(P<0.01);而转染pc-KLK10后，KTC-1细胞中KLK10表达水平显著提高(P<0.01)。此外，沉默KLK10明显抑制TPC-1的细胞活力，促进细胞凋亡；相反，过表达KLK10显著促进KTC-1细胞活力，抑制其凋亡(图2B和2D,P<0.01)。

图2 KLK10沉默和过表达对PTC细胞活力和凋亡的影响

2.3 KLK10沉默和过表达对细胞葡萄糖代谢的作用

通过GEPIA在线软件分析，发现KLK10与GLUT1和HK2分别呈正相关(图3A)。GLUT1和HK2是葡萄糖代谢途径的关键基因[12]。随后，进一步评估KLK10在PTC葡萄糖代谢中发挥的作用。结果显示，与si-NC组相比，si-KLK10减少PTC中葡萄糖消耗(图3B,P<0.01)、乳酸产生(图3C,P<0.01)和ATP浓度(图3D,P<0.01),具有显著性差异。同时，KLK10沉默显著降低TPC-1细胞中GLUT1和HK2蛋白表达水平(图3E,P<0.01)。然而，转染pc-KLK10的KTC-1细胞表现出完全相反的作用(图3B-3E)。

2.4 KLK10通过FAK/SRC/PI3K/AKT轴调节甲状腺乳头状癌进展

蛋白免疫印迹结果表明，与si-NC组相比，si-KLK10组中p-FAK/FAK,p-SRC/SRC,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值分别下降约46%,57%,41%和30%(图4A)。过表达KLK10明显提高了FAK、SRC、PI3K和AKT的磷酸化水平(图4A,P<0.01)。此外，分别用FAK抑制剂(PF562711)、SRC抑制剂(Dasatinib)和PI3K/AKT抑制剂处理，均可抑制pc-KLK10转染细胞的活力(图4B,P<0.01),促进细胞凋亡(图4C,P<0.01),减少葡萄糖消耗和乳酸的产生(图4D和4E,P<0.01)。

3、讨论

据报道，KLK10参与多种癌症的进展。KLK10敲除可抑制结直肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[10]。过表达KLK10诱导胃癌细胞对曲妥珠的耐药性[13]。在胰导管腺癌中，KLK10表达的增加与预后不良和生存期缩短显著相关[9]。在这些癌症中，KLK10作为一种肿瘤启动子发挥作用。相反，在其他几种癌症中KLK10被认为是一种肿瘤抑制因子。在宫颈癌中，KLK10的表达与肿瘤的恶性进展呈负相关[14]。过表达KLK10可延缓前列腺肿瘤的增殖速度[8]。然而，KLK10在甲状腺乳头状癌中的作用和调节机制还不清楚。前人的研究通过生物信息学分析认为KLK10在甲状腺乳头状癌中上调[11,15]。一致地，我们通过数据库分析和体外检测证实在甲状腺乳头状癌中KLK10的表达上调。此外，沉默KLK10抑制PTC细胞活力，并诱导细胞凋亡。

图3 KLK10沉默和过表达对PTC细胞葡萄糖代谢的作用

代谢重编程被认为是癌症的一个标志，其特征是无论是否存在氧气，癌细胞利用糖酵解而不是线粒体氧化磷酸化进行代谢，伴随着葡萄糖的摄取，乳酸的产生以及ATP的产生，从而促进肿瘤的生长和进展[16]。近年来，糖酵解也成为甲状腺乳头状癌治疗的潜在靶点。Jing等[17]发现萜烯七脂酸治疗可抑制甲状腺癌细胞的糖酵解能力，从而抑制肿瘤的生长。此外，Hypoxia up-regulated 1(HYOU1)沉默也被认为可抑制甲状腺乳头状癌的糖酵解和恶性进展[18]。我们的结果表明KLK10沉默减少甲状腺乳头状癌的葡萄糖消耗、乳酸产生和ATP水平，以及GLUT1和HK2蛋白的表达水平。此外，前人的研究发现KLK10通过激活FAK/SRC/ERK轴调节胰导管腺癌的转移[9]。而SRC可通过调节PI3K/AKT介导肝细胞癌的糖酵解[19]。因此，我们认为KLK10推测可能通过介导FAK/SRC/PI3K/AKT参与调节甲状腺乳头状癌的恶性进展。结果表明，KLK10过表达促进FAK、SRC、PI3K和AKT的磷酸化。FAK、SRC和PI3K抑制剂处理显著逆转KLK10过表达对甲状腺乳头状癌的作用。据报道，TGF-β通过SRC/FAK通路诱导甲状腺癌细胞的EMT和侵袭[20]。维生素C被发现可通过失活PI3K/AKT信号通路抑制甲状腺癌细胞增殖并诱导凋亡[21]。这些证据进一步支持了我们的结论。

综上所述，本研究发现KLK10在甲状腺乳头状癌组织和细胞中上调，沉默KLK10显著抑制甲状腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，并且抑制其糖酵解能力。而过表达KLK10表现出相反的作用。此外，KLK10可激活甲状腺乳头状癌细胞中FAK/SRC/PI3K/AKT轴活性。总之，KLK10通过FAK/SRC/PI3K/AKT轴调节甲状腺乳头状癌糖酵解和恶性进展。

图4 KLK10通过FAK/SRC/PI3K/AKT轴调节甲状腺乳头状癌

基金资助:陕西省自然科学基础研究计划(编号:2022JM-604);

文章来源:唐海利,师娇娇,杨小军,等.激肽释放酶-10在甲状腺乳头状癌进展中的作用和调节机制[J].实用癌症杂志,2024,39(09):1398-1403+1409.