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TLR4信号通路在巨噬细胞调节基质金属蛋白酶9和14中的机制

2020-10-12 1135 上传者：管理员

摘要：目的：探讨Toll样受体4(TLR4)信号通路在细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)所介导的单核细胞白血病细胞株(THP-1)巨噬细胞调节基质金属蛋白酶(MMP)-9、MMP-14中的作用机制。方法：实验分为对照组:THP-1巨噬细胞;刺激组:THP-1巨噬细胞+EMMPRIN(1ng/ml)刺激6h;抑制组:THP-1巨噬细胞+TAK-242(5μmol/L)抑制4h,PBS清洗3次,再加EMMPRIN刺激6h。运用qRT-PCR和Westernblot检测MMP-9、MMP-14基因;MMP-9、MMP-14和TLR4蛋白表达。结果：光学显微镜下观察显示,THP-1单核细胞悬浮生长,呈圆形或类圆形,经100ng/ml佛波酯诱导分化48h,细胞体积增大,可伴有伪足伸出,呈椭圆形、长条梭形或短棒状,95%以上细胞贴壁生长。与对照组比较,刺激组MMP-9、MMP-14基因以及MMP-9、MMP-14和TLR4蛋白表达明显升高,抑制组TLR4蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与刺激组比较,抑制组MMP-9、MMP-14基因以及MMP-9、MMP-14和TLR4蛋白表达明显下降(4.384±0.732vs6.473±0.739,3.178±0.492vs4.937±0.538,0.635±0.115vs0.832±0.114,0.454±0.067vs0.733±0.128,0.206±0.058vs0.481±0.086,P<0.05)。结论：TLR4信号通路在EMMPRIN所介导的THP-1巨噬细胞上调MMP-9、MMP-14表达中起积极作用。

关键词：
Toll样受体4
基质金属蛋白酶9
巨噬细胞
心脑血管
细胞外基质蛋白质类
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动脉粥样硬化作为心脑血管疾病发生、发展的重要病理基础,其确切的发病机制尚不清楚。目前无论是基础实验,还是临床研究,均普遍认为其是一种慢性炎性疾病[1]。研究显示,细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)为Ⅰ型跨膜蛋白,是致动脉粥样硬化性心脑血管病的重要促炎蛋白[2,3]。其从N端到C端依次为1个信号肽、2个细胞外结构域、1个跨膜结构域和1个细胞内结构域。其细胞外结构域所含IgC2型(EC1)结构域中包含一个高糖基化位点,既往研究已证实,仅有高糖基化的EMMPRIN才能诱导合成基质金属蛋白酶,而低糖基化EMMPRIN无法诱导MMP合成[4,5]。因此,IgC2型(EC1)结构域与能否诱导合成MMP密切相关。Toll样受体(TLR)是天然免疫的关键参与者,同时它也是炎症与动脉粥样硬化之间的联系纽带。研究发现,TLR中的TLR4在人冠状动脉粥样硬化斑块破裂部位表达明显增加[6]。研究还发现,可以通过TLR4信号通路来激活MMP-9,从而对胶原基质降解[7,8]。本研究旨在探讨TLR4信号通路在EMMPRIN所介导的单核细胞白血病细胞株(THP-1)调节MMP-9、MMP-14中的作用机制。

1、材料与方法

1.1主要试剂

人THP-1单核细胞(中国,中科院上海细胞库),RPMI-1640培养液(美国,Hyclone公司),FBS(美国,Gibco公司),佛波酯(中国,北京索莱宝公司),高糖基化EMMPRIN(美国,KALANG公司),TAK-242(美国,MCE公司),RT试剂盒(加拿大,abm公司),PCR试剂盒(加拿大,abm公司),MMP-9鼠抗人多克隆抗体(美国,abcam公司),MMP-14鼠抗人多克隆抗体(美国,abcam公司),TLR4兔抗人多克隆抗体(美国,abcam公司)。

1.2THP-1巨噬细胞建模

人THP-1单核细胞在完全培养液(10%PBS+1%青链霉素+89%RPMI-1640培养液)条件下,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱。将细胞数调整为1×106/ml,接种于6孔板,每孔2ml,应用佛波酯(100ng/ml)诱导48h,使之较好地分化为贴壁生长的THP-1巨噬细胞。

实验分组:对照组:THP-1巨噬细胞;刺激组:THP-1巨噬细胞+EMMPRIN(1ng/ml)刺激6h;抑制组:THP-1巨噬细胞+TAK-242(5μmol/L)抑制4h,PBS清洗3次,再加EMMPRIN刺激6h。

1.3qRT-PCR检测基因表达

用Trizol法提取细胞总RNA,同时根据所测RNA浓度,用焦炭酸二乙酯将各组RNA浓度调整为1μg/1μl(方便后续加样);应用RT试剂盒将mRNA逆转成cDNA,cDNA置于冰箱-20℃保存备用。PCR引物序列从Pubmed数据库“Gene”中查找,并经“Primer-BLAST”验证;最后由通用生物(安徽)有限公司合成。所测目的基因引物序列如下:MMP-9上游引物:5′-GCAAGGG-CGTCGTGGTTCC-3′,下游引物:5′-GGTCGTCGGTGTCGTAGTTGG-3′;MMP-14上游引物:5′-CCCCGAAGCCTGGCTACA-3′,下游引物:5′-GC-ATCAGCTTTGCCTGTTACT-3′;以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogrnase,GAPDH)为内参,GAPDH上游引物:5′-GTCATC-AATGGAAATCCCATCA-3′,下游引物:5′-CCA-GTGGACTCCACGACGTAC-3′。扩增条件95℃,酶激活10min,1个循环;然后95℃变性15min,40个循环;最后63.6℃退火/拉伸60min,40个循环。最后应用qRT-PCR予以相对定量。

1.4Westernblot检测蛋白表达

首先是蛋白的提取:现配蛋白裂解预混液(RIPA和PMS体积比100〯1),加入细胞中冰上裂解5min,震摇1h,12000r/min离心10min后,汲取上清液。应用BCA蛋白定量试剂盒对样品蛋白进行定量,根据所测蛋白的浓度,应用十二烷基硫酸钠以及沸水浴煮对样品蛋白进行变性处理。然后根据目标蛋白分子量:MMP-9为92000、MMP-14为66000、TLR4为96000、GAPDH为36000,选择10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离胶;同时配制适量5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶压缩胶。凝胶泳道依次加入20μl待测蛋白,再加5μl的Marker,两侧加入20μl的1×十二烷基硫酸钠;加样后电泳。分离的蛋白以电转膜方式从凝胶转移到硝酸纤维素膜上,转膜后置于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中封闭,室温摇床1～2h。取出硝酸纤维素膜,洗膜,加入稀释好的一抗(鼠抗人MMP-9多克隆抗体,1〯2000;鼠抗人MMP-14多克隆抗体,1〯2000;兔抗人TLR4多克隆抗体,1〯2000;鼠抗GAPDH多克隆抗体,1〯2000),摇床20min,4℃过夜。第2天取出硝酸纤维素膜,洗膜,然后加入二抗(二抗浓度为1〯3000),室温避光孵育60～90min。最后将TBST清洗后的硝酸纤维素膜置于避光显色盒中,分别加入高敏化学发光液A和B,避光孵育3min;最后运用Cannon2.1蛋白分析仪进行检测。以内参GAPDH的灰度值进行校准,得出所测目标蛋白的相对表达量。

1.5统计学方法

采用SPSS17.0统计软件,计量资料以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用成组t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1THP-1巨噬细胞建模成功

光学显微镜下观察显示,THP-1单核细胞悬浮生长,呈圆形或类圆形,经100ng/ml佛波酯诱导分化48h,细胞体积增大,可伴有伪足伸出,呈椭圆形、长条梭形或短棒状,95%以上细胞贴壁生长(图1～3)。

图1～3光学显微镜观察×10

2.23组各目标基因及蛋白表达比较

与对照组比较,刺激组MMP-9、MMP-14基因以及MMP-9、MMP-14和TLR4蛋白表达明显升高,而抑制组TLR4蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与刺激组比较,抑制组MMP-9、MMP-14基因以及MMP-9、MMP-14和TLR4蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05,表1～2,图4)。

表13组MMP-9和MMP-14基因表达比较(x±s,n=9)

表23组MMP-9和MMP-14及TLR4蛋白表达比较(x±s,n=9)

图43组MMP-9和MMP-14及TLR4蛋白电泳图

3、讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病的危险程度,并非由冠状动脉管径的狭窄程度而定,主要取决于冠状动脉粥样硬化斑块的构成及其稳定性[9]。既往研究显示,>68.5%的急性心肌梗死由冠状动脉狭窄程度<50%的易损斑块所引发。

MMP作为一类锌依赖性的内肽酶家族,可降解细胞外基质中的各种蛋白质[10]。在动脉粥样硬化斑块进展过程中发挥着积极的促进作用[11]。其主要通过降解粥样硬化斑块纤维帽的细胞外基质,使纤维帽变薄,进而促进粥样硬化斑块的破裂,并激活血栓级联放大效应,最终继发冠状动脉完全或不完全闭塞的急性心血管事件。MMP家族成员众多,已知的有23种,研究发现其成员中的MMP-9、MMP-14在易损斑块中的表达显著高于稳定斑块,且急性冠状动脉综合征患者外周血MMP-9也明显升高,甚至MMP-9还在急性冠状动脉综合征的临床预后评估中表现出较高的临床应用价值[12,13,14,15]。而作为MMP共同上游始动因子的EMMPRIN,其在上调MMP表达信号通路种类以及机制方面目前尚不明确。本研究首次探讨并揭示TLR4信号通路在EMMPRIN所介导的THP-1巨噬细胞调节MMP-9、MMP-14中的作用机制。

本研究结果显示,刺激组MMP-9、MMP-14基因以及蛋白表达较对照组明显升高,差异有统计学意义。说明EMMPRIN能够明显促进THP-1巨噬细胞中的MMP-9、MMP-14表达上调,同时表明EMMPRIN可能在动脉粥样硬化进展,以及易损斑块的形成、破裂中起一定的负面推动作用。本研究通过应用TAK-242对TLR4进行抑制阻断,进而探讨TLR4信号通路在EMMPRIN所介导的THP-1巨噬细胞调节MMP-9、MMP-14中所起的作用,以及作为化学抑制剂TAK-242的抑制效果。研究结果显示,与刺激组比较,抑制组MMP-9、MMP-14基因及蛋白表达明显下降。这说明TLR4信号通路参与了THP-1巨噬细胞中EMMPRIN所介导的MMP-9、MMP-14表达,其次TLR4信号通路在此调节过程中起重要作用。这也从另一方面肯定了可以通过对TLR4信号通路的靶向阻断,进而延缓和逆转动脉粥样硬化易损斑块的进展。另外,与对照组比较,抑制组TLR4蛋白表达明显下降,说明作为化学抑制剂的TAK-242能够有效抑制TLR4通路。

综上研究所述,TLR4细胞信号通路不仅参与EMMPRIN所介导的THP-1巨噬细胞中MMP-9、MMP-14的调节,而且还在其中扮演着重要的上调作用。因此我们推测TLR4信号通路可能参与了动脉粥样硬化易损斑块的发生与发展,而对TLR4信号通路进行靶向阻断,有望为冠心病的综合防治提供新策略。

王志明,赵嫦清,李泽龙,梁星,杨智华,王先梅,郭瑞威,杨丽霞.Toll样受体4信号通路在巨噬细胞调节基质金属蛋白酶9和14中的作用机制[J].中华老年心脑血管病杂志,2020,22(10):1081-1084.