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脑和脊髓动静脉畸形血管中蛋白质表达谱的差异

2021-11-08 64 上传者：管理员

摘要：目的探讨脑和脊髓动静脉畸形(AVM)在分子水平的表达谱差异。方法提取人脑(bAVM)、脊髓(sAVM)、对照脑血管、对照脊髓血管全蛋白质,通过TMT标记高通量定量蛋白质组学技术检测各组中蛋白质表达水平。结果在bAVM、sAVM、对照脑血管、对照脊髓血管样本中,采用蛋白质组学方法共检测到3102个高可信度蛋白质,在bAVM和sAVM中分别有852个和205个蛋白质的表达水平与其对照组有显著改变。生物信息学分析显示,304个蛋白质仅在bAVM中显著高表达,这些蛋白质主要是线粒体相关蛋白质,主要富集于电子传递链及钙调节通路;97个蛋白质仅在sAVM中显著高表达,主要参与细胞外基质的组成。结论线粒体功能异常及钙调节失衡可能在bAVM畸形血管的病理生理过程中发挥重要作用,细胞外基质组成及其糖基化异常可能参与sAVM畸形血管的进程。

关键词：
线粒体
细胞外基质
脊髓动静脉畸形
脑动静脉畸形
蛋白质组学
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动静脉畸形(AVM)是一类动静脉血管间异常连接的罕见血管疾病，易破裂出血，是患者致残的重要风险因素。常发生于中枢神经系统，包括脑动静脉畸形(bAVM)和脊髓动静脉畸形(sAVM)[1]。

对AVM发病机制的研究多集中于bAVM,如血管形成异常，包括血管生成抑制基因miR-137和miR-195*表达降低[2]、Sox2(transcriptionfactorSOX-2,转录因子SOX-2)-JMJD5(bifunctionalpeptidaseandarginyl-hydroxylaseJMJD5,双功能肽酶和精氨酸羟化酶)作用引起内皮细胞间充质转化(End-MT)[3],细胞间通讯异常[4]。在sAVM发现细胞外基质和血管形成相关蛋白质表达量异常[5]。

此外，在bAVM和sAVM中均发现内皮祖细胞的富集[6]、及KRAS(GTPaseKRas,GTP酶)/BRAF(serine/threonine-proteinkinaseB-raf,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)突变[1]诱导的内皮细胞MAPK-ERK(mitogen-activatedproteinkinase,丝裂原活化蛋白激酶)通路激活[7]。尚无报道两种疾病间的分子表达特异性。对比bAVM和sAVM的蛋白质表达差异，对深入研究bAVM和sAVM的分子机制，开发疾病特异性的诊断或治疗方法具有重要指导意义。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料：

患者bAVM标本(4例)和sAVM标本(4例)来自于清华长庚医院，对照组脑血管(4例)和脊髓血管(4例)来自于国家发育和功能人脑组织库，对照组捐献者无神经系统和血管系统相关疾病。标本详细信息参见表1。所有标本于-80℃保存。本研究已获得中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会审核(伦理批准号：2018008)。经患者知情同意。

1.1.2 试剂：

尿素(urea)、二硫苏糖醇和碘乙酰胺来自于GEHealthcare公司；蛋白酶抑制剂cocktail来自于Roche公司；TandemMassTagTM(TMT)试剂、PBS、甲酸、乙腈、蛋白marker(ThermoScientific公司);Trypsin/Lys-C(Promega公司);三乙基碳酸氢铵溶液、羟胺、考马斯亮蓝染液(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 组织蛋白的提取：

在冷PBS中去除组织中血污染，去除bAVM标本中黏连的脑组织。标本在液氮中迅速冷冻并研磨成粉，加入冷组织裂解液(8mol/Lurea的PBS溶液，含蛋白酶抑制剂cocktail),4℃裂解40min,12000×g离心10min取上清即为组织蛋白提取液。使用超微量分光光度计(NanoDrop2000)测定蛋白质浓度。

1.2.2 蛋白质的还原、烷基化和TMT标记：

组内按等质量混合各样本蛋白质，制备混合蛋白液。每组取100μg上述蛋白液，加入10mmol/L二硫苏糖醇，37℃反应1h,然后加入25mmol/L碘乙酰胺，室温反应1h。加入Trypsin/Lys-C37℃反应过夜，将蛋白酶解成肽段。脱盐后，0.2mol/L三乙基碳酸氢铵溶液溶解肽段，各组加入0.8mgTMT试剂室温标记1h:TMT-126标记bAVM,TMT-128标记对照脑血管，TMT-129标记sAVM,TMT-131标记对照脊髓血管。加入羟胺中和游离的TMT分子，混合各组样品后脱盐。

1.2.3 高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)分级和液相色谱质谱联用(liquidchromatograph-massspectrometry,LC-MS/MS)的检测：

为了提高质谱检测到的蛋白质数量，使用HPLC对肽段进行分组。简要步骤为：多肽溶解于100μL1%甲酸溶液中，注入HPLC分离。分离色谱柱为XbridgeBEH300C18柱子(4.6mm×250mm,Waters),柱温维持45℃;流动相为乙腈和水(pH=10),流速为1mL/min;紫外吸收波长设为214nm。每1.5mL收集为1管，最终合并为12组分，旋蒸去除所有溶剂。

将上述12组分分别溶解于20μL1%甲酸溶液中，进行LC-MS/MS(ThermoQExactive质谱仪)检测。梯度洗脱条件：C18分析色谱柱(300Å,75μm×150mm),0.30μL/min,120min。质谱检测条件：QExactive质谱采取数据依赖性采集模式，Orbitrap(400-1800m/z,60000分辨率)中行全谱扫描，随后以27%碰撞能量(higher-energyC-trapdissociation,HCD)进行10次数据依赖的MS/MS扫描。

质谱获得的数据使用ProteomeDiscoverer2.2软件进行搜库，人源fasta数据库于2020年10月在Uniprot网站下载。

1.2.4 生物信息学分析：

可信蛋白质的筛选条件设置为：uniquepeptide≥2,FDR≤0.01,差异蛋白质的筛选条件设置为：变化倍数≥2.0或≤0.5。蛋白质组数据分析使用到多个分析平台和软件：悟空云平台(https://www.omicsolution.org/wkomics/main/)进行PCA、HCA、相关性分析，Funrich软件进行GeneOntology分析，Cytoscape软件进行ClueGO和蛋白质-蛋白质相互作用分析，网络版WEB-basedGEneSeTAnalysisToolkit进行Wikipathway分析，GraphPadPrism辅助作图。

1.2.5 蛋白质表达水平的验证：

通过Westernblot验证蛋白质在bAVM、sAVM、对照脑血管和对照脊髓血管中的表达水平。由于蛋白质总量有限，将各组的样本按照等质量混合。使用NanoDrop2000超微量分光光度计测定浓度后，将各组蛋白质进行SDS-PAGE分离，通过考马斯亮蓝染色确定各组上样量。将等质量蛋白通过SDS-PAGE分离，电转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉封闭后，使用1∶1000稀释的一抗(MMP9,ab137867,Abcam;VDAC,cst-4866,CellSignalingTechnology公司)在4℃孵育过夜。与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h,化学发光法检测抗原抗体结合条带。

2、结果

2.1 高通量质谱检测bAVM和sAVM中蛋白质表达谱的异同

在对照脑血管、bAVM血管、对照脊髓血管、sAVM血管中共检测到3102个高可信度蛋白质。对照组脑血管和脊髓血管的蛋白质表达谱相近，相关性系数为0.98,bAVM畸形血管中蛋白质的表达丰度与其他3组的差异最大(图1)。

bAVM畸形血管中蛋白质表达量发生变化的蛋白质数量更多(图2A)。相比于对照组血管，bAVM畸形血管中286个蛋白质的表达量下调，566个蛋白质的表达量上调；sAVM畸形血管中90个蛋白质的表达量下调，115个蛋白质的表达量上调。bAVM和sAVM中表达量变化的蛋白质共941个，其中116个蛋白质在两种畸形血管中的表达量均显著改变(图2B)。在本研究中，将这941个蛋白质定义为全部差异表达蛋白质。

941个差异表达蛋白质的HCA分析结果显示(图2C),这些蛋白质可分为12个cluster,其中cluster4中304个蛋白质仅在bAVM血管中显著高表达，cluster5中97个蛋白质仅在sAVM血管中显著高表达。后续对cluster4和cluster5中的蛋白质分别进行分析。

2.2 bAVM畸形血管细胞中线粒体稳态及钙调节失衡

在bAVM中显著高表达的304个差异表达蛋白质主要为线粒体及相关蛋白质，富集于线粒体复合物I、电子传递链、钙调节等信号通路(图3)。

2.3 sAVM中细胞外基质蛋白质及其糖基化异常

sAVM畸形血管中显著高表达的97个蛋白质(cluster5)主要是以ADAM10(disintegrinandmetalloproteinasedomain-containingprotein10)、MMRN1(multimerin-1)、TNC(tenascin)、VCAN(versicancoreprotein)、KNG1(kininogen-1)、LAMB1(lamininsubunitbeta-1)为核心的细胞外基质蛋白或糖蛋白(图4)。

2.4 Westernblot检测bAVM和sAVM中蛋白质表达水平

线粒体蛋白VDAC(voltage-dependentanionchannel)在bAVM中显著高表达，细胞外基质蛋白MMP9(matrixmetalloproteinase-9)在sAVM中显著高表达(图5)。

3、讨论

蛋白质组学技术以蛋白质组为研究对象，可无偏见的、在整体水平探究细胞或组织的蛋白质组成及其动态变化规律。探究bAVM和sAVM的蛋白质组表达，可系统地评估两种疾病的相似和差异，为寻找疾病的特异性分子机制或靶标提供线索。

前期蛋白质组学研究报道，参与细胞间通讯的分子黏附通路蛋白质的表达水平在人bAVM和sAVM畸形血管中均显著改变[4,5]。本文中，作者发现线粒体稳态及钙调节相关蛋白质的表达水平在bAVM中明显改变，细胞外基质蛋白质在sAVM中显著高表达。该结果揭示了bAVM和sAVM特异性的分子特征，为充分理解bAVM和sAVM的分子机制提供参考和补充。

线粒体和内质网是细胞内重要的钙离子储存器，VDAC是线粒体外膜上高表达的钙转运蛋白，通过Grp75(glucoserelatedprotein75)偶联IP3Rs形成大分子转运体，介导线粒体外膜将钙离子从内质网转运至线粒体内[8]。钙离子可直接激活电子传递链和ATP合酶的活性，促进ATP生成[9],调控线粒体能量代谢。在心肌细胞中，抑制线粒体复合物I可引起线粒体能量异常，导致细胞死亡[10]。本文结果显示bAVM中多个线粒体复合物I蛋白的表达水平显著升高，推测线粒体稳态及钙调节失衡在bAVM的病理过程中可能具有重要调节作用。

细胞外基质是存在于细胞间的动态网状结构，由胶原、蛋白聚糖、弹性纤维等大分子物质组成。通过与细胞表面上的受体结合，调控细胞骨架结构，引起细胞内细胞传导，影响细胞的增殖和分化。基质金属蛋白酶ADAM10-Notch通路、细胞外基质糖蛋白TNC-RhoA/ROCK通路可影响内皮细胞间紧密连接参与血管结构稳态调节[11,12,13]。细胞外基质黏附蛋白MMRN1结合内皮细胞vWF(vonWillebrandfactor),稳定血小板黏附[14]。通过ADAMTS5水解VCAN成为versikines,促进血管内皮细胞的黏附、增殖，促进新生血管形成[15]。在本研究中，作者发现以ADAM10、TNC、VCAN、MMRN1为核心的细胞外基质蛋白及糖蛋白的表达水平在sAVM中过表达，在bAVM中的变化差异无统计学意义。提示细胞外基质组成对sAVM血管结构的稳定具有重要调控作用。

本文仍存在一定的局限性：本文结论是基于小样本量蛋白质组学分析的推测，需在大数量样本上进行验证，并在细胞水平进一步证实该结论。

参考文献:

[8]高鹏,杨明,孙林.线粒体相关内质网膜(mam)钙转运及调节蛋白介导线粒体钙稳态[J].中国细胞生物学学报,2018,40:585-593.

[13]王淳,李波,方文刚,等.PLGF通过激活RhoROCK信号通路介导人脑微血管内皮细胞间紧密连接开放[J].基础医学与临床,2013,33:960-965.

文章来源：王乃利,孟姝,仇文颖,王霞.脑和脊髓动静脉畸形血管中蛋白质表达谱的差异[J].基础医学与临床,2021,41(11):1570-1576.