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浅谈大豆异黄酮相关基因GmUGT73克隆和功能鉴定情况

2020-05-29 284 上传者：管理员

摘要：UGT是一类糖基转移酶,它对黄酮类化合物进行糖基化修饰,合成异黄酮糖苷,在异黄酮的合成、转运、存储等方面发挥了重要的作用。为了探索UGT功能,通过RT-PCR方法从中豆27中克隆获得GmUGT73基因的CDS全长序列。利用ProtParamtool等在线软件对GmUGT73蛋白序列及理化性质进行分析,预测结果表明,GmUGT73基因的编码区编码464个氨基酸,分子质量为51.1865ku,理论等电点(pI)为6.27,总原子数为7176,分子式为C2281H3580N608O685S22。GmUGT73蛋白总正电和负电残基数分别为37和41,蛋白的不稳定系数为36.93,表明该蛋白较稳定,蛋白的脂溶指数为86.19,GRAVY值为-0.111,说明该蛋白为亲水性蛋白。将线性植物表达载体与目的片段进行连接,成功构建pCambia3300-GmUGT73植物表达载体,通过发根农杆菌介导法转化大豆毛状根并获得转基因阳性根系,利用高效液相色谱(HPLC)对根系进行异黄酮含量测定,结果表明,转基因阳性根中异黄酮含量与对照相比极显著提高(P<0.01),说明该基因可能具有促进合成大豆异黄酮的功能。

关键词：
候选基因
克隆
农杆菌转化
基因功能鉴定
大豆
异黄酮类
糖基转移酶
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大豆是我国重要的粮食作物和油料作物,也是我国人民植食性蛋白的主要来源[1]。异黄酮是一种黄酮类化合物,又称植物雌激素[2],包括游离型的大豆黄素、染料木素和黄豆黄素3种[3],主要存在于大豆、菜豆、苜蓿等豆科植物中,其中以大豆的含量最高[4]。大豆异黄酮是大豆重要的次生代谢产物之一。它不仅参与调节植物的生长活动,还对人体健康具有重要作用。为了满足市场对大豆异黄酮的需求,高异黄酮含量的大豆品种选育成为育种人员的重要目标之一。

异黄酮主要通过苯丙氨酸代谢途径进行生物合成,这一途径是从莽草酸途径衍生的植物特有的次生代谢途径,也是植物三大次生代谢途径之一[5]。在自然状态中,异黄酮以3种母核的形式存在,它们通过β-糖苷键和葡萄糖结合,形成异黄酮葡萄糖苷,在大豆中存在[6]。黄酮类色素等次生代谢产物的糖苷主要经过糖基化修饰,存在于植物天然次生代谢产物合成的最后一步[7]。UGT是存在于自然界中的一种重要修饰分子,UDP(尿嘧啶二磷酸腺苷)所活化的糖分子也能被UGT转移到生物大分子上。UGT可修饰大豆中的黄酮类化合物,形成异黄酮糖苷,也是异黄酮的合成过程中的一类重要次生代谢产物[8]。目前,UGT基因已在多种植物(如水稻[9]、玉米[10]、荞麦[11]、三花龙胆[12])中被研究,付晓雯[8]从葛根中成功克隆出具有糖基转移酶活性的GT4基因,并验证该基因可以影响大豆苷元、染料木素、黄豆黄素等物质的合成。李红艳等[13]在丹参中成功克隆糖基转移酶基因SmUF3GT,发现其可以将不稳定的类黄酮色素转化为稳定类黄酮苷元。尤章[14]发现紫花苜蓿中MsUGT73B2基因影响黄酮物质的合成。Achnine等[15]发现蒺藜苜蓿GT99D基因参与合成黄酮类物质。而大豆糖基转移酶基因功能尚鲜见报道。

本研究以高异黄酮品种中豆27为试验材料,克隆GmUGT73全长序列并构建植物表达载体pCambia3300-GmUGT73,利用发根农杆菌介导大豆快速转化技术来验证GmUGT73基因与异黄酮含量的关系,进而为分子标记辅助育种提供基因资源。

1、材料和方法

1.1试验材料

大豆品种:中豆27由中国农业科学院作物所培育;东农50由东北农业大学大豆研究所提供。

菌种和载体:K599发根农杆菌、pCambia3300载体、大肠杆菌DH5α感受态。

1.2试验方法

1.2.1大豆总RNA提取及反转录

将大豆材料中豆27的种子种在12cm×12cm的小方钵中,钵中装灭菌蛭石。将材料放置于16h光和8h暗,温度(23±2)℃,湿度60%的光照培养箱内。待大豆幼苗第一轮三出复叶完全展开时,取叶片组织15～30mg,置于液氮中,依照TRIzol的方法提取高异黄酮品种中豆27叶片的总RNA。采用东洋坊反转录试剂盒说明书进行操作,将RNA反转录成cDNA。

1.2.2GmUGT73的生物信息学分析

通过测序获得了DNA序列,并且利用DNAMAN软件将其翻译氨基酸序列。利用ProtParam、ProtCcale、TMpred和MEMSAT-SVM在线软件,可以对氨基酸的理化性质、亲水性、疏水性、跨膜结构等指标进行初步分析,进而初步预测基因的功能。

1.2.3RT-PCR法克隆GmUGT73全长基因

在Phytozomev11.0数据库查找GmUGT73基因的全长序列,GmUGT73CDS区域全长1395bp,根据GmUGT73基因的CDS序列设计引物(表1),将cDNA作为模板DNA进行PCR扩增,反应体系和反应程序根据高保真DNA聚合酶(PhantaSuper-FidelityDNAPolymerase)说明书进行操作。用琼脂糖凝胶电泳检测的方法对目的基因片段进行电泳检测。

表1PCR引物

1.2.4目的片段回收

获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,紫外灯照射下,用解剖刀迅速切下含目的片段的琼脂糖凝胶(质量一般小于0.3g),放入干净的1.5mL离心管中,利用胶回收试剂盒将目的片段进行回收,放入-20℃冰箱中保存。

1.2.5表达载体构建与目的基因片段连接

在pCambia3300表达载体上找到单酶切位点,采用XbaⅠ酶,在37℃水浴锅中5h将其载体线性化,采用电泳的方法检验酶切结果。采用电击法将目的片段与植物表达载体相连接,采用的大肠杆菌感受态DH5α是博迈德生物技术公司生产的。

1.2.6菌液验证及测序

利用PCR鉴定阳性克隆的方法,对菌液进行PCR检测(Easy-Taq为PCR扩增酶)。将鉴定为阳性克隆的菌液送到测序公司测序。利用OMEGA公司生产的提质粒盒子(PlasmidMiniKit(D6942-02*))对测序合格的样品提取质粒。

1.2.7大豆根部转化与异黄酮含量测定

根据陈安乐[16]大豆发根转化方法对GmUGT73基因以东农50为材料进行K599发根农杆菌转化与侵染,对根部进行DNA提取,采用PCR鉴定的方法,并根据朱莹等[17]液相色谱法(HPLC)测定异黄酮含量的方法,对大豆根部异黄酮进行测定。

2、结果与分析

2.1GmUGT73基因的克隆与转化

选取中豆27的第一轮完全展开的三出复叶提取总RNA,通过琼脂糖电泳检测,其中18S和28S条带清晰可见(图1)。通过Nanovue仪器对提取的总RNA进行浓度检测,结果表明,RNA纯度较高,完整性好,适合反转录成cDNA,进行基因克隆。

图1RNA电泳图

将中豆27的第一轮三出复叶总RNA逆转录成cDNA,并以其为模板、GmUGT73-R和GmUGT73-F为引物,经PCR反应后获得目的片段,其长度为1000～2000bp,与目的基因片段长度一致(图2),然后通过In-Fusion连接的方法将目的基因连接到植物过表达载体上。

对转化大肠杆菌的菌液进行PCR阳性检测(图2),将阳性克隆的菌液送至测序公司进行测序,下载全基因组基因序列与测序结果比对,将完全匹配的序列作为最终序列。

图2目的基因电泳图

2.2生物信息学分析

利用在线软件对GmUGT73蛋白序列的一级结构进行分析,结果表明,GmUGT73基因的编码区编码464个氨基酸,分子质量为51.1865ku,理论等电点(pI)为6.27,其原子总数为7176,其分子式是C2281H3580N608O685S22。在GmUGT73蛋白的氨基酸序列中,含量最多的是Leu,占总数的11.6%;不存在Pyl和Sec2种氨基酸。GmUGT73蛋白质总正电和负电残基数分别为37和41,蛋白不稳定系数为36.93,表明该蛋白相对比较稳定。GmUGT73蛋白GRAVY值为-0.111,脂溶指数为86.19,属于亲水性蛋白。蛋白质二级结构预测得到GmUGT73蛋白质中含有33.19%α-螺旋、41.59%片层结构、4.74%β-转角、20.47%无规则卷曲。用在线软件SWISS-MODEL预测中豆27中GmUGT73蛋白的三级结构(图3)。

图3GmUGT73蛋白三级结构的预测

2.3PCR鉴定发根农杆菌阳性克隆

用基因克隆引物对含有目的基因的发根农杆菌采取PCR阳性鉴定,结果显示,菌液均为阳性克隆,代表目标转化成功(图4)。

2.4转基因阳性根鉴定

对接种20d后的发根植株,随机选取10株,提取根部中的DNA,采用PCR检测的方法对其进行阳性鉴定,结果显示其中9株为阳性(图5)。

图4pCambia3300-GmUGT73转大肠杆菌PCR初步鉴定

图5PCR鉴定阳性根结果

2.5转基因阳性根异黄酮含量测定

随机选取5株转基因阳性根,并将其与对照处理同等条件下采用高效液相色谱(HPLC)进行异黄酮相关含量的测量,结果显示,转基因阳性根中大豆苷元和大豆苷含量极显著高于对照材料,其他组分无显著变化,对2组数据进行差异性分析,差异达极显著水平(P<0.01),所以初步认定GmUGT73基因具有促进异黄酮合成的作用(图6)。

图6转基因阳性根异黄酮含量

3、讨论与结论

转基因技术和基因编辑技术不断提高,伴随产生了更多的遗传转化方法和技术,给分子育种和定向改良作物性状提供新思路。至今在植物中使用较多的方法有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等,其中科研人员最为热衷的是农杆菌介导法,主要是其价格成本低、耗时短[18]。采取发根农杆菌转化的方法,可以影响次生代谢产物的合成[19]。证明发根农杆菌转化在筛选异黄酮合成基因方面具有可行性。付晓雯[8]研究发现,葛根中异黄酮含量受到糖基转移酶相关基因的影响。Baek等[20]研究发现,朝鲜黑莓中糖基转移酶基因在类黄酮合成过程中发挥重要作用。本研究通过发根农杆菌介导法将GmUGT73基因转入东农50品种中,获得15个转基因阳性根,用高效液相色谱法测定转基因阳性根组织的异黄酮含量,验证GmUGT73基因是否参与大豆异黄酮的合成过程。结果证明GmUGT73基因可能参与大豆异黄酮的积累过程。

大豆异黄酮多以苷元形式发挥生物功能,糖基化后其生理作用发生改变[21,22,23]。因此,糖基化对异黄酮组分的生物功能具有重要的作用。最早发现的大豆异黄酮特异UGT基因是GmIF7GT,它是在大豆幼苗中提取出来的[24],它对异黄酮合成具有促进作用。后来Dhaubhadel等[25]发现UGT73F2糖基转移酶基因可以促进染料木素和黄酮黄豆黄素合成,从而使黄豆黄苷和染料木苷的含量增多。本研究以中豆27为试验材料,克隆出糖基转移酶基因GmUGT73,连接pCambia3300过表达载体,通过K599转化发根农杆菌,结果表明,发根中的大豆苷元(Daidzein)和大豆苷(Daidzin)含量增加,异黄酮含量显著提高,这表明GmUGT73参与大豆异黄酮代谢过程。

通过RT-PCR方法从大豆中豆27中克隆获得GmUGT73基因的CDS全长序列;GmUGT73基因编码区编码464个氨基酸,分子质量为51.1865ku,该基因编码的蛋白比较稳定,亲水性较强;成功构建pCambia3300-GmUGT73植物表达载体,发根农杆菌介导法转化大豆东农50,获得的转基因阳性根中异黄酮含量和对照处理相比极显著提高(P<0.01),说明该基因可能具有合成大豆异黄酮的功能。

参考文献：

[3]李冬梅.基于全基因组关联分析的大豆异黄酮组分基因克隆与功能鉴定[D].沈阳:沈阳农业大学,2018.

[5]钟巍然,柴友荣,张凯,陈晓丹,卢坤,陶澜.苯丙烷代谢途径中细胞色素P450的研究[J].安徽农业科学2008,36(13):5285-5289.

[6]高荣海,张春红,赵秀红,郑艳,刘长江.大豆异黄酮研究进展[J].粮食与油脂,2009(5):1-4.

[8]付晓雯.葛根糖基转移酶基因的克隆与功能鉴定[D].武汉:华中农业大学,2017.

王俊,董海冉,常宏,王伟,包冬芳,赵孝岳,赵雪,韩英鹏.大豆异黄酮相关基因GmUGT73克隆及功能初步鉴定[J].华北农学报,2020,35(02):43-47.

基金:国家科技重大专项和重点研发项目(课题)省级资助项目(GX17B002);黑龙江省杰出青年基金项目(JC2018007);黑龙江省博士后项目(LBH-Q17015);国家重点研发计划项目(2016YFD0100304);国家自然基金面上项目(31671717).