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激光捕获显微切割技术在皮肤病研究中的应用

  2021-12-28    73  上传者:管理员

摘要:激光捕获显微切割技术(LCM)是一种直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取靶细胞的新技术,该技术能从组织样本中分离出同质的细胞群体,从而提取高纯度的DNA、RNA和蛋白质。LCM技术在银屑病、白癜风、特应性皮炎等疾病的研究中,提供了一种提取细胞的方法,从而避免了培养细胞等传统提取细胞的手段带来的各种弊端。本文综述了激光捕获显微切割技术的原理、技术流程及其在银屑病、白癜风等皮肤疾病研究中应用。

  • 关键词:
  • 人表皮细胞
  • 基因表达分析
  • 激光捕获显微切割
  • 皮肤病学
  • 组织形态
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激光捕获显微切割技术(,LCM)是在不破坏组织结构、保持要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下,直接从冰冻或石蜡包埋的组织切片中获取靶细胞。激光捕获显微切割技术通过捕获人表皮细胞,并与实时定量PCR、质谱分析等技术相结合,提取并研究正常表皮基因组及蛋白质等。通过激光捕获显微切割技术抓取荧光标记后的肿瘤细胞、黑素细胞等对皮肤老化、皮肤肿瘤、银屑病、白癜风等常见皮肤疾病的特征细胞精准分析,从而得到不同疾病皮肤特征细胞的基因特异性表达,为皮肤病学研究提供了更为灵敏快速的研究方法。本文综述了LCM技术的原理、技术流程及其在皮肤病学研究中应用。


1、激光捕获显微切割技术简介


激光捕获显微切割技术是一种在显微可视化下从组织标本中分离纯细胞群体的先进技术。它可以精确地找到并捕获感兴趣的细胞,以进行广泛的下游分析。1986年初,Monajembashi提出用激光微束对人类染色体进行显微切割,首次描述了激光微束显微切割技术的概念。1996年,Emmert-Buck详细描述了LCM技术的概念及操作。与此同时,PalmMicroBeam和LeicaLMD6000激光捕获显微切割系统也迅速发展起来。由于这项技术的发展,使得疾病病理过程的分子分析方法有了显著的突破[1,2]。


2、激光捕获显微切割技术的原理及技术流程


LCM有两大类:红外激光捕获系统和紫外激光切割系统。红外激光捕获系统的工作原理是可视化下在目标细胞上方的LCM帽上附着一层热塑性转移膜,低功率脉冲激光通过LCM帽的顶部,击中热塑性转移膜,然后热塑性转移膜结合到目标细胞或区域,吸收激光辐射,形成一种非破坏性的显微切割,从而保持捕获材料的完整性。而紫外激光切割系统则是将固定好的组织转移到聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜玻片上,用紫外光激光切割目标区域,使其掉落到放置在组织载玻片下面的管帽中。虽然这样会损坏位于切割区域周边的细胞,干扰最终的下游分析,但相比起红外激光捕获系统操作过程中附着在粘合剂薄膜上的目标组织,紫外激光切割系统的直接切割对组织的污染更小。显微切割完成后,将靶细胞放入含有适当缓冲液的试管中,用于提取DNA、RNA或蛋白质,并回收生物分子用于下游分析[2,3]。


3、激光捕获显微切割技术在皮肤病研究领域的应用


LCM技术在病理学、传染病学等领域应用广泛[3],而在皮肤病学研究领域应用较少。

3.1 正常皮肤研究

LCM技术在正常皮肤基因组学的研究中起到了不可替代的作用。Gulati等[4]利用LCM技术分离了正常皮肤真皮网状层、表皮基底层和基底层上(棘层、颗粒层和角质层)三个区域,发现LCM捕获到的表皮全层与基底层上表皮的基因表达截然不同,这表明LCM技术在捕获基底层细胞时有很好的靶向性。研究通过结合LCM技术和二代测序(NGS)技术,从新鲜冷冻皮肤人体活检中获得可靠的RNA测序数据,形成cDNA文库,为下游分析提供可靠的数据,也为转录组学研究提供了扩大样本量的机会[5]。

2013年,研究则采用LCM技术分离正常人下肢和乳房部位皮肤组织基底膜、真皮乳头层和网状层区域,获取细胞外基质。通过质谱分析发现,真皮乳头层和网状层的亚蛋白质组、腿部皮肤与乳房皮肤的蛋白质组之间的差异不大。这项研究为LCM用于皮肤病学蛋白质的相关研究提供了强有力的依据[6]。

3.2 皮肤老化研究

LCM技术在研究皮肤老化方面也有应用,研究采用LCM技术和实时定量PCR相结合的方法,检测了青年和老年人皮肤中肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)的表达,发现HGF主要在人皮肤真皮成纤维细胞中表达,老年人皮肤中HGF表达升高伴随着Hippo抑癌基因信号通路相关基因表达降低,进一步揭示了成纤维细胞表达的HGF在衰老皮肤中的作用机制[7]。

3.3 皮肤肿瘤研究

从染色的组织切片中利用LCM技术分离出仅包含数十个细胞的单个微肿瘤巢,进行全基因组扩增,发现急性黑素瘤基因组异质性广泛存在,且分支进化发生在急性黑素瘤发展的早期。进而可以在早期将黑色素瘤与良性痣区分开[8]。近期研究利用LCM技术分离黑素瘤组织与邻近正常组织,分析发现由威罗非尼(Vemurafenib)通过内质网应激在黑色素瘤细胞中诱导微小核糖核酸MiR-410-3P下调。它驱动肿瘤转向侵袭性表型,并抵抗肿瘤细胞中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶编码基因的抑制作用。这项研究提示了黑色素瘤耐药性的一种新机制[9]。

3.4 银屑病

在研究银屑病时,用LCM技术和二代测序(NGS)技术研究了银屑病患者表皮和真皮炎性浸润物中miRNA的特异性表达谱。与银屑病患者正常皮肤相比,银屑病斑块表皮中有24个miRNAs表达下调,真皮炎性浸润物中有37个miRNAs表达下调[10]。此研究证明miRNAs可能与银屑病的发病有关,LCM结合NGS技术是一种探索银屑病皮肤表皮和真皮中miRNA的整体表达的有效方法。采用LCM技术分别对寻常银屑病患者皮损与非皮损区的真皮和表皮进行了研究,结果发现皮损区表皮中circRNA表达较非皮损区显著下调[11]。

3.5 白癜风

Goldstein等[12,13,14]先使用NKI-beteb抗体标记人皮肤组织分化的和前体的黑素细胞,后经LCM技术,捕获原位黑素细胞提取RNA。LCM技术可以直接从黑素细胞和相邻的角质形成细胞群体中分离出高质量RNA进一步扩增,并通过实时定量PCR进行分析。与角质形成细胞相比,经窄谱紫外线处理的黑素细胞样本中黑素细胞特异性基因酪氨酸酶蛋白基因等显著上调,角质形成细胞特异性基因角蛋白5和角蛋白14的表达显著高于黑素细胞样本。此外,研究还发现毛囊隆突的黑素细胞与表皮黑素细胞相比,毛囊隆突的黑素细胞特异性基因的表达显著降低,而三个黑素细胞干细胞基因:Y染色体性别转录基因盒转录因子9,WNT抑制因子1和分泌型卷曲相关蛋白1的表达显著增强。将LCM技术提取的毛囊隆突黑素细胞前体进行全转录组RNA进行测序后,发现与正常皮肤相比经窄谱紫外线治疗的白癜风皮肤毛囊隆起黑素细胞中特异性基因的表达显著增加。而这些信号是白癜风重新着色过程中毛囊隆突的黑素细胞前体激活的潜在因素。

3.6 其他皮肤疾病

在皮肤其他疾病方面,2015年研究采用LCM技术分离特应性皮炎患者皮损区、非皮损区皮肤和健康志愿者正常皮肤的表皮和真皮,并进行基因表达和免疫染色研究。研究发现了新的免疫和屏障基因,并发现了在阵列研究上通常无法检测到的特应性皮炎关键基因,如白介素22、胸腺基质淋巴细胞生成素、巨噬细胞来源趋化因子和嗜酸细胞活化趋化因子3表达的增加[15]。

在面部播散性粟粒性狼疮患者皮肤肉芽肿性病变病因学研究方面,研究发现使用LCM技术从患者皮肤肉芽肿性病变中提取目的细胞及其DNA。发现痤疮丙酸杆菌在面部播散性粟粒性狼疮患者的肉芽肿性病变中起致病作用。为面部播散性粟粒性狼疮患者的肉芽肿性病变病因学研究提供了强有力的证据[16]。

2017年,Jumper等[17]首次通过结合LCM技术和转录组学的方法,发现在瘢痕疙瘩(KD)中可能存在癌样干细胞群体,这种细胞群在KD中的存在似乎与炎性浸润有关,为这种疾病所特有的持续生长,复发和多药耐药性提供了合理的解释。LCM技术提取细胞和基因谱分析相结合的方法为不同KD区域的基因特征提供了更好的定义,从而更好地鉴别KD与其他皮肤纤维疾病。


4、研究前景展望


构成皮肤的细胞多种多样,分离特定的细胞类型对于皮肤病学研究是一种至关重要的研究方法。经典的方法是用酶将真表皮进行分离。但是这种方法不能区分型别不同的细胞。此外,早期发育阶段的表皮极薄,不易剥离。皮肤原代角质形成细胞的培养为分析提供了一种有效的替代方法,但由于生长条件的改变和缺乏正常的上皮-间充质相互作用,结果导致培养的细胞与真实的体内细胞基因表达不同。近年来,基于各种表面标记的荧光激活细胞分选(FACS)已成为分离不同群体皮肤细胞的研究方法。但荧光标记有很大的局限性。还有用流式细胞仪分离所需的细胞类型。这些方法通常涉及复杂的转基因小鼠品系的培育、给药,以实现时空方式精确控制GFP的表达,操作较为繁琐[18]。

激光捕获显微切割(LCM)可直接从组织切片收集所需的目的细胞,来比较不同类型皮肤细胞各个时期的基因表达,且不需要依赖已知的细胞表面标记或进行复杂而昂贵的转基因实验。LCM技术允许在活检组织切片中分离细胞,这为皮肤病学研究提供了一种更为便利的分离不同类型细胞的研究方案。

然而,LCM技术还存在一些如提取细胞的样本量小、存在一定程度RNA降解、邻近细胞的核糖核酸物质的污染、对于蛋白质的捕获精度不高等缺陷,相信随着技术的发展,LCM技术将会更加完善,应用领域进一步拓宽。


文章来源:郑雨洁,鲁严.激光捕获显微切割技术在皮肤病研究中的应用[J].中国麻风皮肤病杂志,2022,38(02):132-134.

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期刊名称:皮肤科学通报

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出版地方:陕西

专业分类:医学

国际刊号:1001-8077

国内刊号:61-1101/R

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创刊时间:1984年

发行周期:双月刊

期刊开本:16开

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