摘要:目的:评价免疫荧光染色法在皮肤活检组织真菌染色中的应用价值。方法:经组织病理和组织培养确诊的43例皮肤真菌病患者对其石蜡包埋切片分别进行免疫荧光染色、PAS染色。结果:43例皮肤真菌病中PAS染色阳性27例(62.8%),免疫荧光染色阳性30例(69.7%),免疫荧光染色法较PAS染色阳性率有所提高,两者差异无统计学意义(P>0.05)。同时两种方法均阴性患者5例,两种方法联合真菌检出阳性率为88.4%。结论:免疫荧光染色是提高皮肤活检组织中真菌检出的重要补充。
真菌感染是皮肤科常见皮肤病之一,分为浅部真菌病和深部真菌病。真菌病原学检查是诊断真菌病的根本依据,真菌病原学检测手段一直以来也是临床最为迫切的需求。目前真菌检测方法主要包括直接镜检、真菌培养、血清学试验、组织病理学检查等。组织病理学检查方法主要有苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸-雪夫氏液染色(PAS)、Gomori六胺银染色(GMS)等。
近年来又出现了真菌免疫荧光染色技术[1],其荧光染料的主要成分是荧光增白剂(CFW),能与多种植物以及真菌细胞壁上的几丁质和纤维素亲和,在350~400nm波长下发出亮蓝色荧光;因真菌细胞壁含有几丁质和纤维素的β葡聚糖成分,在荧光显微镜视野中能清晰观察真菌形态。我们对43例皮肤真菌感染其中深部真菌感染病例41例石蜡包埋切片进行免疫荧光染色,并与传统的PAS染色法进行比较,以期为病理技术中真菌的检测提供一种新的辅助方法。
1、对象与方法
1.1 研究对象
回顾研究山东第一医科大学附属皮肤病医院2019年1月至2020年12月临床确诊的43例皮肤真菌感染患者,其中男19例,女24例,平均年龄59.3岁;感染部位:面部10例,上肢13例,手14例,指甲1例,胸部2例,背部2例,下肢1例。其中包括:孢子丝菌37例,着色真菌1例,花斑癣1例,马拉色菌1例,其他真菌感染3例。入选标准同时满足以下条件:(1)病理活检组织学上明确诊断感染性肉芽肿或浅部真菌病;(2)真菌镜检与培养证实为真菌感染。
1.2 检测试剂
荧光染色剂工作液(济南德亨医学科技有限公司);PAS染色剂:自配(碱性品红:上海试剂三厂)。
1.3 实验方法
将入选的43例真菌病患者的石蜡包埋组织块2μm连续切8片,每张载玻片捞片4张,脱蜡至水洗,分别进行免疫荧光染色和PAS染色。
PAS染色:滴加高碘酸室温孵育10分钟;蒸馏水洗,滴加shiff氏液,室温孵育20分钟,流水冲洗,苏木素衬染,脱水、透明、封片;光学显微镜下观察。
免疫荧光染色:在暗室内,将免疫荧光染色剂直接滴加在待检标本上,盖上盖玻片,立即放置于荧光显微镜下观察。
1.4 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件,两种真菌检测法阳性率比较采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 镜下表现
PAS染色:需每个视野仔细查找,耗时长;镜下表皮基底膜呈红色线状或带状,真菌孢子呈圆形或椭圆形,孢子壁呈红色圆环状;真菌菌丝呈红色棒状或条状;背景为蓝紫色(图1)。
免疫荧光染色:低倍镜即可快速发现孢子或菌丝,耗时短;镜下真菌孢子呈圆形或椭圆形,呈亮蓝色或蓝绿色;真菌菌丝呈亮蓝色棒状或条状;背景呈暗蓝色(图1)。
2.2 PAS染色与免疫荧光染色两种方法比较
43例皮肤真菌病患者中PAS染色阳性27例(62.8%),免疫荧光染色阳性30例(69.7%)。经卡方检验,PAS染色法阳性率与直接免疫荧光染色法阳性率比较:χ2=0.468240,P=0.493798,两者之间无统计学意义。
2.3 免疫荧光与PAS两种染色方法联合使用
43例皮肤真菌病患者PAS染色与免疫荧光染色两种方法均阳性19例(44.2%),其中有一种方法阳性38例(88.4%),两种方法均阴性5例(11.6%),见表1。
3、讨论
真菌可以引起皮肤、黏膜、皮下组织及其它器官的感染,在感染性疾病中,真菌感染病原菌种类最多,发病率最高、流行也最广。皮肤是人体的一大器官,真菌感染常先表现在皮肤上,皮肤真菌感染分为浅部真菌病和深部真菌病。真菌的检出对临床的诊断和治疗显得尤为重要。
组织病理对真菌病的诊断具参考意义,HE染色、六胺银染色、PAS染色是真菌组织病理最常用的检测方法。HE染色对曲霉和结合菌、着色芽生菌等染色较好,不掩盖真菌本身的颜色,是必不可少的染色方法,但大多数真菌HE染色后,组织颜色与真菌颜色相近,不易分辨,为了更好的显示组织中的真菌,常需要其他特殊染色方法,如六胺银、PAS染色。六胺银能将真菌细胞壁着棕黑色,可清晰显示真菌轮廓与形态,但操作复杂,染液不能长期保存,且假阳性率较高。PAS染色可使真菌胞壁着色深红,胞质呈浅红,操作方法相对简单,但品红染液配制过程复杂,对配制器皿清洁度要求极高,极易配制失败,且染色过程耗时长,脱蜡进水后的切片,完成PAS染色平均时长约40分钟,且组织中含中性粘多糖的组织和细胞均着色容易形成共染现象,不易分辨,可能出现漏诊现象[2]。
与六胺银和PAS染色相比,免疫荧光染色检测能够高效、特异性地结合真菌细胞壁中的几丁质和纤维素的β葡聚糖等,在355nm紫外光激发下与真菌结合的荧光染色剂会迅速发出亮蓝色荧光,与周围背景对比强烈,从而可以在荧光显微镜快速查找到真菌。国外免疫荧光染色早已广泛应用于真菌检测[3]。而国内由于荧光显微镜的缺乏等,免疫荧光染色法在真菌病诊断上的应用起步较晚,目前应用石蜡包埋组织切片的检测研究较少[4,5]。本研究将临床确诊的43例皮肤真菌感染病例石蜡包埋切片进行免疫荧光染色,在皮肤组织中免疫荧光染色可以快速清晰显示真菌菌丝、孢子结构,较PAS染色阳性病例略有提高,但两者之间结果无统计学意义(P>0.05),但将两种方法联合使用可明显提高真菌检出率(表2)。
为提高真菌免疫荧光染色的检出率,在免疫荧光染色过程中应注意:(1)需要有一定阅片经验的病理诊断医师结合HE染色正确判读,勿将背景中的胶原纤维或杂质误认为真菌菌丝孢子,可加入KOH溶液降低背景;(2)需多个切面观察,在操作过程中容易脱片,建议使用防脱切片且多切几个切面;(3)荧光染料试剂需避光保存,常温保存期一般为半年至一年;(4)荧光染色后容易发生减退或淬灭,染色后应立即放荧光显微镜下读片、拍照,切片无法长期保存。
综上所述,真菌免疫荧光染色在皮肤活检组织中是一种高效、快速、准确显示真菌菌丝孢子的检测方法,与PAS染色联合使用可明显提高真菌检出率,是提高皮肤真菌病真菌检出的重要补充方法,值得在皮肤真菌病检测中推广应用。
参考文献:
[2]马天,宋月星,邹先彪.真菌的组织病理学特殊染色[J].中国真菌学杂志,2011,6(6):367-369.
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文章来源:陈学超,于永翔,王建文,暴芳芳,周桂芝,陈声利,卢宪梅,刘永霞.免疫荧光技术在皮肤活检组织真菌染色中的应用[J].中国麻风皮肤病杂志,2022,38(02):101-103.
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期刊名称:国际皮肤性病学杂志(英文)
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主管单位:中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
主办单位:中华医学会,中国医学科学院中国协和医院大学皮肤病研究所
出版地方:江苏
专业分类:医学
国际刊号:2096-5540
国内刊号:32-1880/R
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