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大黄素对黑素瘤细胞B16F10的迁移能力及NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响

2020-05-30 767 上传者：管理员

摘要：目的：研究大黄素对黑素瘤细胞B16F10的迁移能力及NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响。方法：CCK-8试验、划痕愈合试验及Transwell迁移试验检测大黄素对黑素瘤细胞B16F10活性和迁移能力的影响,Westernblot法检测大黄素对黑素瘤细胞B16F10中NLRP3炎症小体相关蛋白表达的影响。结果：CCK-8试验显示,与对照组相比,使用不同浓度大黄素处理24h及48h后,黑素瘤B16F10细胞的细胞活性受到明显抑制(P<0.05)。划痕愈合试验结果显示,与对照组相比,使用20、40、60μmol/L大黄素处理后,黑素瘤B16F10细胞的划痕愈合能力显著下降。Transwell试验显示,与对照组相比,使用20、40、60μmol/L大黄素处理24h后,穿过隔膜的细胞明显减少(P<0.05),提示大黄素可以抑制黑素瘤B16F10细胞的迁移能力。Westernblot结果显示,与对照组相比,使用20、40、60μmol/L大黄素处理24h后,NLRP3蛋白的表达水平明显下降。结论：大黄素可抑制黑素瘤细胞B16F10细胞的迁移能力,其机制可能与NLRP3炎症小体相关蛋白的下调有关。

关键词：
B16F10细胞
大黄素
皮肤肿瘤
细胞迁移
黑素瘤
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黑素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤,尽管早期切除对于早期黑素瘤有着较好的疗效,但是黑素瘤易发生早期转移,存在恶变前播散及远处平行进展的转移形式,一旦发生远处转移,常标志着患者较差的预后。同时,黑素瘤的转移也是限制目前靶向治疗、免疫疗法的重要因素。因此,防止黑素瘤细胞的迁移有着重要的临床价值。大黄素(6-甲基-1,3,8-3羟基蒽醌)是大黄、虎杖、何首乌等中药中提取的主要有效单体,在肝癌、胃癌、肺癌等多种癌症中发挥抗癌作用。本实验将观察大黄素对黑素瘤细胞B16F10迁移的影响并探究可能的作用机制。

1、材料与方法

1.1细胞株及主要试剂

小鼠黑素瘤细胞B16F10购于上海中乔新舟生物科技有限公司,DMEM高糖培养基、胰酶购于美国Hyclone公司,胎牛血清购于美国Gibco公司,CCK-8试剂盒购于日本同仁公司,NLRP3抗体购于英国Abcam公司,羊抗兔荧光二抗购于美国Millpore公司,Transwell小室购于美国Corning公司。

1.2细胞培养及处理

培养细胞使用DMEM培养基含有10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素以及1%谷氨酰胺。细胞培养于37℃,5%CO2恒温培养箱。细胞每隔2～3d传代,选择处于对数生长期、生长状态佳的细胞用于实验。大黄素溶解于二甲基亚砜(DMSO),配制成200mmol/L的溶液,储存于-20℃备用,在加入细胞前使用细胞培养基稀释至工作浓度,相同浓度的DMSO作为阴性对照。

1.3CCK-8细胞活性检测

将B16F10加入96孔板(每孔1×104个细胞),加入含有不同浓度大黄素的完全培养基(0、20、40、60、80μmol/L),持续培养24、48h。PBS清洗3遍后,每孔加入10%的CCK-8溶液,在培养箱中孵育1h,使用酶标仪检测450nm处的吸光度。细胞活力(%)=(A大黄-A空白)/(ADMSO-A空白)×100%。

1.4细胞划痕试验

B16F10细胞接种于6孔板(每孔1×106个细胞),置于37℃,5%CO2培养箱中培养,待细胞达到90%融合状态后,在6孔板底部使用灭菌100μL枪头做间隔约1cm的平行划痕,洗去细胞碎片后,加入含有梯度浓度大黄素的无血清培养基(0、20、40、60μmol/L),对照组中加入相同浓度的DMSO。在0h和24h,使用倒置显微镜观察细胞划痕愈合情况并拍照。

1.5细胞迁移试验

将无血清DMEM培养基饥饿处理24h的B16F10细胞消化,使用无血清DMEM培养基重悬成1.5×106/L的单细胞悬液。在Transwell小室的上室加入含有大黄素(0、20、40、60μmol/L)的细胞悬液200μL,在对照组中加入含有等量DMSO的细胞悬液。在Transwell下室加入500μL含10%胎牛血清的完全培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中培养24h。取出小室,用棉签轻柔擦去小室膜上表面的细胞,4%多聚甲醛固定30min,结晶紫染色20min,PBS清洗3遍。使用倒置显微镜观察小室膜下表面细胞并拍照。每张膜选取5个随机视野计数,做统计学分析。

1.6Westernblot法检测炎症小体相关蛋白NLRP3的表达

B16F10消化后接种于6cm培养皿中,细胞贴壁后弃去原培养基,加入5mL含有0、20、40、60μmol/L大黄素的完全培养基,37℃,5%CO2恒温培养箱中继续培养48h。弃去培养基,PBS清洗2遍,加入细胞裂解液,收集蛋白。使用BCA法确定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳,转膜,含5%脱脂牛奶的TBST封闭1h。用NLRP3抗体(1∶500),4℃孵育过夜。TBST洗膜3次后加入对应二抗室温孵育1h,TBST洗膜3次后加入ECL发光液,拍照储存图像。

1.7统计学处理

多组间的比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),两组间的比较采用t检验(Student′sttest),所有的计量资料以x±s表示。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1大黄素抑制B16F10细胞增殖

CCK-8结果显示,大黄素具有抑制B16F10细胞活性的作用,且该作用呈现剂量依赖性(图1)。大黄素作用24h后,各实验组的细胞活性明显下降,20、40、60、80μmol/L的大黄素处理后的细胞存活率分别为(68.93±2.09)%、(51.83±6.05)%、(49.55±2.72)%、(46.60±1.98)%,差异具有统计学意义(t=14.90,13.80,18.53,26.95;P<0.05)。48h各组的细胞存活率分别为(60.64±2.77)%、(32.11±5.36)%、(16.22±2.44)%、(16.14±2.84)%,差异同样具有统计学意义(t=14.21,12.67,34.39,29.53;P<0.05)。当大黄素浓度超过60μmol/L时,细胞活性下降的趋势减缓,这可能与大黄素较低的水溶性有关。

图1不同浓度大黄素对B16F10细胞活性的影响

2.2大黄素抑制B16F10细胞划痕愈合能力

20、40、60μmol/L的大黄素作用于B16F10细胞24h后,划痕的愈合速度与对照组相比明显降低,提示大黄素可以抑制黑素瘤细胞B16F10的迁移能力(图2)。

图2大黄素抑制B16F10细胞的划痕愈合能力(×100)

2.3大黄素抑制

B16F10细胞的迁移能力与对照组相比,不同浓度的大黄素作用24h后,迁移至小室膜下表面的B16F10细胞显著减少,呈现剂量依赖性,且差异具有统计学意义(t=10.30,17.78,20.35;P<0.05),提示大黄素可以抑制黑素瘤细胞B16F10的迁移运动(图3)。

图3Transwell试验中大黄素对B16F10细胞迁移能力的抑制

2.4大黄素抑制NLRP3炎症小体相关蛋白的表达

与对照组相比,不同浓度的大黄素处理细胞48h后,NLRP3蛋白的表达明显下降,提示大黄素具有抑制炎症小体形成的作用(图4)。

图4大黄素抑制NLRP3蛋白的表达

3、讨论

黑素瘤作为最凶险的皮肤肿瘤之一,发病率呈现上升态势[1]。黑素瘤较易发生远处转移,且远处转移常标志着患者预后的显著恶化[2]。近年来,转移性黑素瘤的治疗取得了多方面的进展。化学治疗、靶向治疗以及免疫疗法的运用,使得约一半的患者可以长期生存[3]。但是,黑素瘤的异质性导致了耐药性的出现[4]。因此,预防黑素瘤的转移仍是改善预后的重要环节。含核苷酸结合域及亮氨酸富集区受体是一类在固有免疫中发挥重要作用的模式识别受体。NLRs可以被炎症或应激产生的损伤相关的分子模式)、病原相关分子模式[5]以及新定义的稳态预警分子过程[6]激活。激活后的NLRs继而完成对炎症小体的激活。炎症小体是一种多种蛋白组成的复合体,被激活后可作为一系列信号级联的起始,介导包括白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白介素-18(interleukin-18,IL-18)在内的炎性细胞因子的成熟和释放。

NOD-likereceptorprotein3(NLRP3)是NLR家族中研究较为充分的成员。一项瑞典的病例对照研究显示,NLRP3基因的多态性与散发性黑素瘤的易感性有关[7]。Okatomo等[8]报道,在晚期的黑素瘤细胞中,NLRP3炎症小体出现了持续性的自激活,导致了白介素-1β的自发性分泌。但是,早期和中期的黑素瘤细胞分泌IL-1β时,仍需要外源性的刺激。同时,减少环境中的NLRP炎症小体也可以抑制黑素瘤细胞的转移潜能[9]。这些研究揭示了NLRP3炎症小体的激活在黑素瘤进展中发挥的重要作用。

大黄素作为大黄、虎杖、何首乌等中药的重要活性成分,被报道在多种肿瘤中发挥显著的抑癌作用。例如,大黄素在胃癌细胞BGC-823中通过调节PI3K途径,HIF-α和己糖激酶Ⅱ,继而促进细胞凋亡,抑制糖酵解,从而抑制肿瘤细胞的增殖[10]。通过诱导凋亡,大黄素也可以在体外抑制肝癌细胞的增殖[11]。在胰腺癌中,大黄素可以调控转化生长因子-β信号通路和血管生成相关的micro-RNA,在动物模型中抑制胰腺癌的血管生成[12]。此外,大黄素还被发现具有逆转肿瘤耐药性的功能。例如,大黄素可以逆转非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)的耐药性[13],通过降低MRP1基因的表达,大黄素可以增加顺铂对卵巢癌的抑制作用[14]。此外,大黄素的抗耐药作用也在卵巢癌、胃癌、胆囊癌、胰腺癌等肿瘤中被报道[15,16]。

同时,也有许多研究结果显示大黄素具有显著的抗炎作用[17,18]。研究表明,大黄素可以作用于P2X7受体[19]、抑制TLR4/NF-κB或促进Nrf2达到减少ROS生成的结果,降低体内炎症水平[20,21]。而ROS被认为是NLRP3炎症小体激活的重要诱因之一[22]。在人脐静脉内皮细胞中,大黄素可以通过抑制NLRP3炎症小体的形成,抑制细胞焦亡[23]。

在本实验中,笔者发现大黄素在抑制黑素瘤细胞B16F10的迁移能力时,也降低了NLRP3炎症小体相关基因的表达水平,提示NLRP3可能是大黄素抑制黑素瘤细胞转移的关键蛋白。但是大黄素在体内是否能发挥相同的作用以及是否可能存在其他通路仍需进一步的研究。本实验为抑制黑素瘤的转移提供了新思路。

参考文献：

[2]王丽,栗玉珍.黑素瘤的分子发病机制和靶向治疗新进展[J].中国皮肤性病学杂志,2012,26(2):164-166,174.

[10]关波,张松,郭舜,等.大黄素抑制胃癌细胞糖酵解并促进凋亡[J].现代生物医学进展,2018,18(13):2437-2441.

[11]倪华,王钦.大黄素在体外诱导人肝癌Hep3b细胞凋亡的作用及机制[J].中国老年学杂志,2017,37(14):3434-3436.

[13]欧阳学农,房文铮,吴淡森,等.大黄素逆转非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药的机制研究[J].临床肿瘤学杂志,2014,19(11):967-971.

[23]吴树宁,王凯,施思,等.大黄素预处理对LPS/ATP诱导的人脐静脉内皮细胞焦亡的影响[J].山西医科大学学报,2019,50(4):410-414.

王万晨,刘驰,袁铭杰,陈亮,刘天一.大黄素对黑素瘤细胞B16F10迁移的影响[J].中国皮肤性病学杂志,2020,34(06):622-626.