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参芪升免方对MB49小鼠膀胱癌细胞的影响及作用机制

2025-08-21 32 上传者：管理员

摘要：目的：初步探讨参芪升免方对MB49小鼠膀胱癌细胞的影响及作用机制。方法：采用水煎煮法获取参芪升免汤剂，然后加工制备成参芪升免冻干粉，用完全培养基将其稀释成低剂量（10μg/mL）、中剂量（25μg/mL）和高剂量（30μg/mL）的药物组；采用CCK8方法检测不同浓度参芪升免对MB49细胞增殖的作用；应用平板克隆、划痕实验和Transwell实验分别检测参芪升免对MB49细胞生长、迁移和侵袭能力的影响。结果：CCK8检测结果表明不同浓度的参芪升免对MB49小鼠膀胱癌细胞的增殖具有抑制作用且呈剂量依赖性（P﹤0.05）；平板克隆、划痕实验和Transwell实验结果表明MB49细胞生长、迁移及侵袭能力随着参芪升免浓度增加而降低（P﹤0.05）。结论：参芪升免方能够抑制MB49小鼠膀胱癌细胞的增殖、迁移及侵袭，且呈剂量依赖性。

关键词：
MB49细胞
NMIBC
参芪升免方
泌尿系肿瘤
膀胱癌
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膀胱癌是临床上常见的泌尿系肿瘤之一,其中70%~75%为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle-invasivebladdercancer,NMIBC)[1]｡经尿道肿瘤切除术(transurethralresectionofbladdertumor,TURBT)是临床治疗NMIBC的主要手段,但术后复发率高达50%~70%[2]｡基于NMIBC低分级､低进展和高复发率的生物学特性,膀胱腔内免疫制剂和化疗药物灌注已成为TURBT术后预防NMIBC复发的首选方案[3]｡

湖北省中医院泌尿外科长期专注于中西医结合方法治疗膀胱癌的临床研究,根据膀胱癌中医病机,自拟参芪升免方,其临床疗效较好｡笔者通过细胞实验研究参芪升免方对MB49小鼠膀胱癌细胞的增殖､迁移和侵袭的影响及作用机制,现报道如下｡

1、材料与方法

1.1仪器与试剂:CO2培养箱(武汉赛默飞世尔科技有限公司);血球计数板(上海求精有限公司);酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司);CX-31型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);低温离心机(美国赛洛捷克公司)｡CCK-8(大连美伦生物技术有限公司);0.25%Trypsin-EDTA､青/链霉素(武汉赛默飞世尔科技有限公司);DMEM培养基､PBS缓冲液(武汉普诺赛生命科技有限公司);胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司);结晶紫染色液(北京兰杰柯科技有限公司)

｡1.2实验细胞:MB49小鼠膀胱癌细胞(商城北纳创联生物科技有限公司,编号:BNCC363369,批号:231220)｡

1.3实验药物:参芪升免方(药用:党参､黄芪､当归､炒白术､苦参､丹参､姜黄各15g,茯苓､甘草､白花蛇舌草各10g,熟地黄12g,延胡索､白茅根各20g),由湖北省中医院提供｡按上述比例称取药物重量约187g｡将药物用冷水浸泡30min,以浸泡后淹没药材2~3cm为度,后使用砂锅煎煮｡先用武火煎至微沸,再用文火煎煮,煎煮30min,煎煮两次｡再将两次煎煮好的汤药倒在一起过滤去除药渣,得到澄清药液｡

1.4冻干粉制备:冻干粉于中南民族大学药学院制备,将上述澄清药液低温浓缩,然后进一步过滤浓缩液,确保无杂质,再将浓缩液倒入冻干托盘,放入冷冻室预冻至-40℃以下,确保完全冻结,然后冷冻干燥,确保冻干粉含水量达标,再将冻干块粉碎成细粉,通过筛网确保粉末均匀细腻,最后将冻干粉包装储存备用｡用完全培养液稀释成500μg/mL的储备液,用时再稀释成对应浓度｡

2、方法

2.1细胞鉴定:由专职病理老师在倒置显微镜下观察鉴定细胞,并结合商城北纳创联生物科技有限公司提供的细胞资料,鉴定为MB49细胞株,见图1｡

图1MB49细胞形态

2.2细胞培养:MB49小鼠膀胱癌细胞用DMEM培养基培养,该培养基中含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素｡细胞放置在37℃(含5%浓度CO2)的细胞培养箱中｡

2.3细胞计数:准备细胞悬液,台盼蓝染色,用酒精擦拭血球计数板及盖玻片,用移液枪吸取10~20μL细胞悬液,缓慢注入计数板边缘加样槽,液体通过毛细作用充满计数室,将计数板置于显微镜载物台,低倍镜(10×)下找到计数网格,计数四角大格(每大格含16小格)内的细胞｡

2.4CCK-8方法检测细胞存活率:消化细胞并计数,将细胞浓度调为5×104个/mL,按每孔100μL的体积将细胞悬液加入96孔板中｡孔板中细胞培养过夜后,弃去培养基,加入不同浓度的含药培养基,待孔板中细胞分别培养24h,弃去培养基,加入CCK8工作液10μL｡于细胞培养箱中孵育3h后测得CCK8工作液在450nm处的吸光值｡计算各组吸光值,并根据公式计算IC50｡

2.5平板克隆实验检测细胞生长增殖能力:从细胞处于对数生长期状态开始,通过胰酶消化将细胞完全悬浮于完全培养基中,并进行准确计数;在每个实验组中,控制细胞数量在400~1000个细胞/孔的范围内,并接种于6孔板;持续培养至14天,或直到大多数单个克隆中的细胞数超过50个｡在培养过程中,每隔3天更换培养基,并观察细胞状态｡克隆形成完成后,使用1mL4%多聚甲醛进行细胞固定,固定20min｡最后,用PBS洗涤;向每个孔中加入1mL结晶紫染液,染色15min;利用PBS进行多次细胞洗涤,分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照｡

2.6细胞划痕实验检测细胞迁移能力:取适量细胞铺板,培养至细胞融合度为90%｡用枪头划出一条划痕,弃去培养基,用PBS吹吸1遍｡更换新鲜培养基后进行加药处理,继续培养24h｡每孔选5个视野分别在0､24h时间点拍照｡使用ImageJ对图片进行分析,按公式计算划痕愈合率｡

2.7Transwell实验检测细胞的侵袭能力:用无血清培养基按1∶10稀释Matrigel,Transwell小室加入该液100μL,37℃凝胶化4~6h｡用无血清培养基悬浮细胞,调整浓度为1×106cells/mL｡在24孔板底部加入600L含10%FBS的培养基,作为趋化剂;Transwell小室加入200μL无血清细胞悬液｡放置37℃､5%CO2培养箱中孵育24h｡用棉签轻轻擦去小室未迁移的细胞;多聚甲醛固定30min,结晶紫染色20min｡然后在显微镜下随机选取视野计数膜下表面的细胞,用ImageJ等软件分析｡

2.8统计学分析:采用统计软件SPSS25.0进行统计分析,使用GraphPadPrism8.0绘图｡计量资料以(均数±标准差)表示,多组数据间比较采用one-wayANOVA分析｡

3、结果

3.1不同浓度的参芪升免方对各组MB49细胞吸光度值的影响:见图2｡与对照组比较,1μg/mL和5μg/mL的参芪升免对MB49细胞吸光度值的影响无统计学差异,剩余组的药物浓度都能降低细胞吸光度值,且有一定的浓度依赖性趋势(P﹤0.05)｡

图2不同浓度的参芪升免方对各组细胞吸光度值的影响

3.2通过CCK8确定药物的IC50:使用参芪升免方处理小鼠膀胱癌MB49细胞后浓度效应曲线显示:25.34μg/mL是MB49细胞的半数抑制浓度,见图3｡后续实验以空白组(0μg/mL),低剂量组(10μg/mL),中剂量组(25μg/mL),高剂量组(30μg/mL)进行｡

图3CCK8实验检测加入参芪升免方后MB49细胞存活率和半数抑制浓度

3.3不同浓度的参芪升免方对MB49细胞生长增殖的影响:见图4｡通过平板克隆形成实验表明,参芪升免方可以抑制膀胱癌细胞的生长｡与对照组比较,实验组MB49细胞的生长受到抑制,克隆数量明显减少,且随着浓度的不断升高,克隆数量越来越少(P﹤0.05)｡

图4平板克隆形成实验检测参芪升免方处理后各组细胞的克隆数量变化

3.4不同浓度的参芪升免方对MB49细胞迁移能力的影响:见图5｡通过细胞划痕实验表明,随着时间的推移,与对照组比较,MB49小鼠膀胱癌细胞划痕愈合率随参芪升免浓度梯度降低而呈上升趋势(P﹤0.05),表明参芪升免方具有抑制MB49细胞迁移能力的作用,且剂量越高抑制效果越好｡

3.5不同浓度的参芪升免方对MB49细胞侵袭能力的影响:见图6｡通过Transwell实验表明,与对照组比较,实验组侵袭的MB49细胞数量随着药物剂量的升高而不断下降,呈剂量依赖性(P﹤0.05)｡

图5细胞划痕实验检测参芪升免方处理后各组细胞的迁移能力变化

图6Transwell实验检测参芪升免方处理后各组细胞的侵袭能力变化

4、讨论

膀胱癌归属于中医血尿､淋症等范畴｡《素问·气厥论篇》指出:“胞移热于膀胱则癃溺血”,《金匮要略》中记载:热在下焦则血尿,《诸病源侯论》认为:“由肾虚而膀胱热之故也”,这些条文阐述了古人对膀胱癌病机的认识｡现代有学者[4]提出脾肾亏虚,湿热瘀毒积聚膀胱是导致膀胱癌的主要病机,治以健脾补肾,活血通淋｡该研究使用自拟参芪升免方,方中党参､黄芪扶正固本､健脾益气,脾气运化,化生气血以资肾精;配伍当归､熟地黄填补肾精;辅以茯苓､白术健脾利水渗湿;佐以白花蛇舌草､白茅根､苦参清热燥湿､凉血解毒､利尿通淋;配合丹参､姜黄､延胡索以破血行气､活血通瘀;甘草调和诸药｡

该研究通过多种实验方法评估参芪升免方对MB49膀胱癌细胞的抑制作用｡CCK-8实验结果显示该复方可显著降低肿瘤细胞活力,且呈现剂量依赖性特征,提示其可能通过干扰细胞代谢通路或线粒体功能发挥细胞毒性作用｡在平板克隆形成实验中,药物处理组形成的细胞集落数量显著减少,表明该复方不仅能抑制短期细胞增殖,还可能通过诱导DNA损伤或细胞周期阻滞(如G0/G1期阻滞)削弱肿瘤细胞的长期自我更新能力｡在细胞迁移能力方面,划痕实验显示参芪升免方可显著延缓创面愈合速度,这种迁移抑制效应可能与其调控上皮-间质转化(EMT)进程相关｡Transwell侵袭实验进一步证实该复方具有降低肿瘤细胞穿透基质胶的能力,这可能涉及对基质金属蛋白酶(MMPs)家族表达的抑制,特别是MMP-2/MMP-9的活性调节,从而破坏细胞外基质降解这一侵袭关键步骤｡

从组方配伍分析,复方中多味中药可能发挥协同作用,其有效成分复杂,具有多靶点调控的特点｡黄芪多糖可以抑制膀胱癌UM-UC-3细胞的增殖､迁移和侵袭,并阻滞细胞周期于G0/G1期,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路活化有关[5]｡党参总皂苷可以抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖,其机制可能与调控miR-142-3p/MARCH7轴有关[6]｡姜黄素可以通过调控AKT/PI3K信号通路在体外抑制膀胱癌细胞增殖和迁移,还可以通过抑制NF-κB信号通路在体内抑制膀胱癌细胞的增殖[7]｡二氢丹参酮可能通过GSK3β/Wnt信号通路对T24细胞增殖和侵袭起抑制作用,并阻滞细胞周期于S期[8]｡方中还涉及的有效成分如隐丹参酮､丹参酮ⅡA､氧化苦参碱､芒柄花黄素等可以调控多条信号通路,抑制肿瘤细胞增殖､迁移､侵袭,从而发挥抗肿瘤作用[9]｡

该研究目前仅限于体外实验,初步探讨参芪升免方对膀胱癌细胞的作用,后续需要通过动物实验验证其体内疗效,并进一步采用蛋白质组学或转录组学技术揭示具体作用靶点｡此外,复方中各组分的贡献度及其配伍增效机制仍需通过拆方研究加以阐明｡

参考文献:

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[4]孙阳,周钱梅,苏式兵.中药配伍对癌症治疗的研究进展[J].世界中西医结合杂志,2015,10(10):1476-1480.

[5]刘宏伟,陈瑞琦,熊洪,等.黄芪多糖通过调控JAK2/STAT3信号通路抑制膀胱癌UM-UC-3细胞增殖､迁移与侵袭[J].山西医科大学学报,2023,54(11):1442-1448.

[6]刘红梅,王志鹏,刘志刚.党参总皂苷通过调控miR-142-3p/MARCH7轴影响乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡[J].毒理学杂志,2021,35(6):465-469.

[7]吴金生,王清明,郑传秋,等.姜黄素对N-甲基亚硝基脲诱发膀胱癌大鼠化学干预作用及机制分析[J].中国实验动物学报,2017,25(5):567-571.

[8]倪建华,朱江波,殷国林,等.二氢丹参酮经GSK3β/Wnt途径调节膀胱癌T-24细胞增殖及侵袭的机制研究[J].中国药师,2020,23(7):1256-1260.

[9]王思宇,王宇.中药有效成分对膀胱癌信号通路的调控作用[J].世界科学技术-中医药现代化,2022,24(5):1902-1910.

基金资助:湖北省自然科学联合基金项目(编号:2024AFD262);

文章来源:胡文凤,周洁,范洁,等.参芪升免方对MB49小鼠膀胱癌细胞的影响及作用机制[J].山西中医,2025,41(08):59-61+65.