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微小RNA-137调控帕金森致病基因参与癫痫发生的作用机制

2021-11-05 116 上传者：管理员

摘要：目的初步探究微小RNA-137(miR-137)调控帕金森致病基因(Parkin)发挥抗癫痫机制。方法选择SD健康清洁级雄性大鼠60只建立癫痫模型后随机分为模型组、低表达组、阴性组、3-MA组、联合组(n=12),分别给予生理盐水、miR-137低表达溶液、miR-137阴性对照溶液、自噬抑制剂3-MA溶液、miR-137拮抗剂联合3-MA溶液。另取12只大鼠为对照组,给予生理盐水。检测海马组织miR-137、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、线粒体自噬受体蛋白(NIX)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Capase-3)表达水平。结果与对照组比较,其他5组大鼠海马组织miR-137、Racine评分明显升高,模型组神经元凋亡率、阳性线粒体数目、LC3-Ⅱ、NIX、Capase-3表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较,低表达组miR-137表达、Racine评分、神经元凋亡率、Capase-3降低,阳性线粒体数目、LC3-Ⅱ、NIX升高(P<0.05),3-MA组Racine评分、神经元凋亡率、Capase-3明显升高,阳性线粒体数目、LC3-Ⅱ、NIX表达明显降低(P<0.05)。联合组Racine评分、神经元凋亡率、Capase-3表达明显高于低表达组[(43.61±2.23)分vs(18.28±1.11)分,(25.68±1.29)%vs(13.34±1.24)%,1.96±0.19vs1.44±0.15,P<0.05];联合组阳性线粒体数目、LC3-Ⅱ、NIX明显低于低表达组(P<0.05)。结论下调miR-137可促进Parkin转位入线粒体,促进线粒体自噬,发挥神经元保护作用,并减轻癫痫症状。

关键词：
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3
帕金森病
微RNAs
癫痫发作
线粒体
自噬
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癫痫是由脑神经异常放电引起的一种慢性神经系统疾病[1,2]。我国癫痫患者以每年40万的速度递增，且发病机制复杂，是临床研究的热点之一[3]。近来研究发现，线粒体自噬参与神经元凋亡、轴突及突触传递、兴奋毒性传导等过程而在癫痫发生发展过程中起重要作用[4,5]。由22个核苷酸组成的非编码微小RNA(microRNA,miR)在癫痫患者脑及神经元中大规模异常表达，影响神经突触结构改变及神经元凋亡、自噬过程，而受到临床研究的重视[6,7]。miR-137可抑制线粒体自噬相关受体表达来抑制低氧诱导的线粒体自噬，且已有文献证实miR-137可抑制帕金森致病基因(Parkin)向受损线粒体内膜转移，导致受损线粒体不能及时清除并在帕金森患者海马及脑皮质层堆积，引起帕金森患者脑神经元凋亡，预示miR-137/Parkin轴介导的线粒体自噬可能在神经系统疾病中发挥重要作用[8]。但miR-137/Parkin轴是否调控线粒体自噬并影响癫痫病理过程，鲜见报道。本研究建立大鼠癫痫模型，对此进行探讨，以期阐明癫痫发生发展的机制，并为癫痫的靶向治疗提供新思路。

1、材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

戊四氮(购自北京寰宇科创生物科技发展有限公司);Parkin自噬抑制剂3-MA(购自美国Sigma公司);Parkin、线粒体自噬受体蛋白(NIX)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinylaspartatespecificproteinase-3,Caspase-3)等抗体(均购自美国Abcam公司);尼氏染色液(购自上海一研生物科技有限公司);逆转录试剂盒(购自上海海方生物技术有限公司);TUNEL染色试剂盒(购自武汉益普生物科技有限公司);DYY-7C荧光共聚焦显微镜(购自上海晶安生物科技有限公司)等。

1.2 实验动物与分组

SD健康清洁级雄性大鼠72只，体质量180～200g,6～7周龄，购自北京北方艾特生物科技有限公司，使用许可证号为SCXK(京)2020-0005。本研究经本院动物伦理委员会批准IACUC-01(20200317)。实验符合3R原则。取大鼠参照文献[9]经腹腔注射戊四氮建立大鼠癫痫模型，并于注射10min后，按Racine评分标准判断大鼠的癫痫发作级别，若大鼠连续3d发作Racine评分≥Ⅳ级，视为造模成功，共造模成功60只。将造模成功的大鼠按随机数字表法分为模型组、低表达组、阴性组、3-MA组、联合组，每组12只。另取12只大鼠为对照组，腹腔注射等量生理盐水。各组大鼠在分组后继续每隔1d注射戊四氮干预，并于注射前30min开始给药，低表达组和阴性组分别给予miR-137低表达溶液及miR-137阴性对照溶液(1nmoL/50μl混悬液，按50μl/kg的体积经尾静脉注射给药，1次/2d);3-MA参照文献[10]设置剂量，3-MA组按2μl/只体积(浓度为100mmol/L)腹腔注射3-MA溶液，1次/2d;联合组尾静脉注射miR-137拮抗剂同时，腹腔注射相应剂量的3-MA溶液，模型组及对照组注射相应剂量生理盐水，各组均连续给药干预30d(共15次)后，取材，进行后续实验。

1.3 观察指标

1.3.1 行为学观察及Racine评分

每次给药后1h观察各组大鼠行为30min,参照文献[11]采用Racine评分法观察并评估大鼠癫痫症状，共观察15次，总分以75分计算。Racine评分标准为：0级，大鼠行为正常，0分；Ⅰ级，面部和耳部抽搐，1分；Ⅱ级，大鼠单侧前肢抽搐，2分；Ⅲ级，大鼠双侧前肢完全抽搐(不直立),3分；Ⅳ级，强直性阵挛发作(有直立行为),4分；Ⅴ级，广泛(全身)的强直性阵挛发作(失去平衡并跌倒),5分。各组共观察15次，每次30min,总分为75分。

1.3.2 透射电镜观察线粒体超微结构

每组随机取6只大鼠麻醉处死，于冰上开颅取脑并分离海马CA1区组织，迅速放入中性甲醛缓冲液固定24h保存备用。剩余6只大鼠麻醉处死，分离海马CA1区组织，剪取部分组织送入电镜室处理并在电镜下观察线粒体结构损伤状况，其他剩余部分组织迅速置于-80℃冰箱保存备用。

1.3.3 尼氏染色及TUNEL染色检测

用尼氏染色测神经元形态，TUNEL染色测神经元凋亡。取上述放入中性甲醛缓冲液固定24h后的海马组织标本，进行常规透明、浸蜡、包埋，取部分切片，按尼氏及TUNEL染色试剂盒说明书进行染色后，置于光学显微镜下观察神经元病理变化，并随机取5个视野，计算细胞凋亡率=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%。

1.3.4 免疫荧光双标记法检测

采用免疫荧光双标记法检测Parkin与线粒体标记蛋白(Tom20)共定位情况。取上述实验剩余切片，用0.5%曲拉通(TritonX-100)透化后，加入一抗抗体(兔抗Parkin、鸡抗Tom20,1〯500稀释倍数)4℃孵育过夜后，加入二抗(TRITC标记的山羊抗兔IgG、FITC标记的山羊抗鸡IgG,稀释倍数为1〯200),孵育显色后，置于荧光共聚焦显微镜下观察、拍照计算阳性线粒体数目。

1.3.5 RT-qPCR检测

采用实时荧光RT-qPCR检测海马组织miR-137表达水平。取部分上述实验中-80℃冰箱保存的海马组织，4℃解冻后，于冰上研磨粉碎，Trizol法提总RNA,以总RNA为模板反转录得到cDNA后，依照RT-qPCR试剂盒说明书及PCR仪扩增。共进行45个循环：95℃110s(1个循环),95℃40s、50～60℃50s、75℃45s(45个循环),75℃260s(1个循环)后终止反应。miR-137以U6为内参，用2-ΔΔCt算法计算miR-137相对表达水平。miR-137正向引物：5′-TTATTGCTTAAT-AATACGCG-3′,反向引物：5′-ACGCGTATTCTTAAGCAATA-3′;U6正向引物：5′-TTCTCCGA-ACGTGTCACG-3′,反向引物：5′-ACGTGACAC-GTTCGGAGA′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.6 Westernblot检测

采用Westernblot检测海马组织中LC3-Ⅱ、NIX、Capase-3表达水平。内参为β肌动蛋白(β-actin),采用增强化学发光法显色，用化学发光成像仪及Image-J软件分析系统检测各组蛋白相对表达水平。

1.4 统计学方法

采用SPSS22.0软件统计分析，数据以x¯±s表示，组间比较进行单因素方差分析，进一步两组间比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠海马组织miR-137表达比较

与对照组比较，其他5组大鼠海马组织miR-137表达明显升高(P<0.05)。与模型组比较，低表达组和联合组大鼠海马组织miR-137表达明显降低(P<0.05,表1)。

2.2 抑制miR-137表达对大鼠癫痫症状评分的影响

与对照组比较，其他5组大鼠Racine评分明显升高(P<0.05);与模型组比较，低表达组大鼠Racine评分明显降低，3-MA组大鼠Racine评分明显升高(P<0.05)。联合组、3-MA组以及阴性组Racine评分明显高于低表达组(P<0.05,表1)。

2.3 抑制miR-137表达对大鼠海马神经元形态的影响

对照组大鼠海马神经元结构正常，染色均匀。模型组大鼠海马神经元肿胀、胞浆染色深浅不一、胞体固缩、模糊。低表达组大鼠海马神经元胞体固缩、肿胀现象有所改善，且形态和染色趋于正常。3-MA组大鼠海马神经元肿胀、胞体固缩现象进一步加重。联合组及阴性组神经元肿胀现象与模型组相近(图1～6)。

2.4 各组神经元凋亡率的比较

对照组、模型组、低表达组、3-MA组、联合组神经元凋亡率分别为(6.01±0.00)%、(21.69±1.69)%、(13.34±1.24)%、(32.52±1.80)%、(25.68±1.29)%。与对照组比较，模型组神经元凋亡率明显升高(P<0.05);与模型组比较，低表达组神经元凋亡率明显降低，3-MA组神经元凋亡率明显升高(P<0.05)。联合组神经元凋亡率明显高于低表达组(P<0.05,图7～12)。

2.5 抑制miR-137表达对大鼠线粒体结构的影响

对照组大鼠海马CA1区线粒体形态结构正常，嵴及膜无损伤。模型组大鼠海马CA1区线粒体水肿、形态不规则、膜边缘模糊、嵴损伤并出现分裂现象。低表达组大鼠海马CA1区线粒体水肿及嵴损伤现象缓解。3-MA组大鼠海马CA1区线粒体水肿、分裂及嵴损伤现象进一步加重。联合组及阴性组线粒体损伤现象与模型组相近(图13～18)。

2.6 抑制miR-137表达后对大鼠海马Parkin与Tom20共定位情况

对照组、模型组、低表达组、3-MA组、联合组阳性线粒体数目分别为(10.01±0.10)个/mm2、(32.54±1.28)个/mm2、(53.34±2.50)个/mm2、(22.52±1.86)个/mm2、(33.66±1.25)个/mm2。与对照组比较，模型组阳性线粒体数目明显增多(P<0.05);与模型组比较，低表达组阳性线粒体数目明显增多，3-MA组阳性线粒体数目明显降低(P<0.05)。与低表达组比较，联合组阳性线粒体数目明显降低(P<0.05)。

2.7 大鼠海马组织相关蛋白表达比较

与对照组比较，其他5组LC3-Ⅱ、NIX、Capase-3蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较，低表达组LC3-Ⅱ、NIX和3-MA组Capase-3表达明显升高，低表达组Capase-3和3-MA组LC3-Ⅱ、NIX表达明显降低(P<0.05)。联合组和阴性组NIX、LC3-Ⅱ表达明显低于低表达组，Capase-3明显高于低表达组(P<0.05,图19,表2)。

3、讨论

戊四氮是理想的致癫痫诱导剂，用戊四氮诱导建立的大鼠癫痫模型发作症状与人类癫痫发作相似[12]。本研究用上述方法建立大鼠癫痫模型后发现，模型组大鼠前肢痉挛、直立、跌倒等癫痫发作症状明显，Racine评分明显高于对照组，并伴随着海马区神经元排列紊乱、肿胀及凋亡等病理损伤，提示造模成功。线粒体自噬与细胞存活、神经突触可塑性及兴奋性传导关系密切[13]。本研究在模型组大鼠海马CA1区检测到线粒体膜边缘模糊且水肿、线粒体嵴损伤及分裂现象，伴随着海马CA1区神经元凋亡率的增加，提示线粒体自噬与癫痫病理进程关系密切。

线粒体自噬清除受损线粒体的过程离不开Parkin参与，其介导的线粒体自噬在神经系统疾病中发挥神经保护作用。Gao等[14]发现，线粒体受损时，Parkin会由细胞质迁移到线粒体中，并促进线粒体泛素化和诱导线粒体自噬。Noda等[15]发现，小鼠Parkin基因缺失，可引起线粒体自噬紊乱、中断，受损线粒体堆积，导致神经元损伤、丢失，认为Parkin介导的线粒体自噬对神经元有保护作用。本研究发现，模型组大鼠海马组织内线粒体结构损伤增多的同时，Parkin与Tom20共定位的阳性线粒体数目多于对照组，而与模型组比较，3-MA组Racine评分、阳性线粒体数目及自噬标志物LC3-Ⅱ表达明显降低，线粒体损伤、神经元凋亡率及凋亡蛋白Capase-3表达明显升高，癫痫症状进一步加重，提示Parkin介导的线粒体自噬，在癫痫病理过程中起保护作用，抑制线粒体自噬，可加重癫痫症状。

非编码小分子miRNA在脑部神经系统疾病及线粒体自噬中的调控作用，受到临床研究重视。Thomas等[16]发现，miR-137与突触前和突触后信号的调控、囊泡及树突形成、电压门控钙通道调控、谷氨酸及糖皮质激素传导、神经元成熟和突触可塑性有关，且miR-137缺失是导致精神分裂症的主要原因，提示miR-137可能调控神经元功能。本研究中，与模型组比较，低表达组大鼠海马组织miR-137表达和神经元凋亡率明显降低，阳性线粒体数目明显增多，对癫痫大鼠体内注射miR-137抑制剂，随着海马神经元中miR-137表达降低，Parkin转位入线粒体增加，癫痫症状及线粒体损伤、神经元凋亡明显缓解。提示抑制miR-137表达可促进Parkin转位入线粒体，促进线粒体自噬，减轻大鼠癫痫症状，发挥神经元保护作用。

综上，miR-137表达可促进Parkin转位入线粒体，促进线粒体自噬，保护海马神经元，减轻癫痫症状。但本研究尚有不足，miR-137/Parkin信号轴除与线粒体自噬有关外，也可能调控突触囊泡内吞功能参与癫痫神经元异常放电过程，有待后续研究。

参考文献:

[4]郭莉琼,刘晓晓,王苗,等.miRNA及其在癫痫发生发展中作用的研究进展[J].山东医药,2020,60(4):110-112DOI:10.3969/j.issn.1002-266X.2020.04.029.

[8]李文,胡喆,林智君,等.miR-137对Parkin诱导的线粒体自噬的影响[J].新医学,2015,(5)-283-288.

[9]刘睿,彭江涛,胡忠波,等布洛芬对慢性癫痫模型大鼠的神经保护作用及其机制研究[J].中华神经医学杂志,2020,19(9):916-923.

[10]叶亮,袁淼,肖文峰脑损伤模型大鼠Pink1/Parkin介导的线粒体自噬作用[J].中国组织工程研究,2020,24(11):1695-1700.

文章来源：胡琼文,李乐雯,吴妹,肖勇,张万里.微小RNA-137调控帕金森致病基因参与癫痫发生的作用机制[J].中华老年心脑血管病杂志,2021,23(11):1209-1213.