摘要:目的研究长链非编码RNA(lncRNA)生长抑制特异性转录本(GAS)5对帕金森病(PD)模型细胞凋亡的影响及潜在机制。方法用2.50mmol/L的MPP+处理SK-N-SH细胞24h建立PD模型细胞,Western印迹检测细胞中B淋巴细胞瘤(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡率,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性,qRT-PCR检测MPP+处理的SK-N-SH细胞中miR-128和lncRNAGAS5的表达,双荧光素酶报告系统验证GAS5与miR-128的调控关系。结果与对照相比,MPP+可促进SK-N-SH细胞凋亡并抑制细胞活性,提高细胞中GAS5含量(P<0.05),降低miR-128含量(P<0.05);抑制GAS5可提高MPP+处理的SK-N-SH细胞活性并抑制细胞凋亡;GAS5靶向负调控miR-128的表达;过表达miR-128可提高MPP+处理的SK-N-SH细胞活性并抑制细胞凋亡;抑制miR-128逆转了抑制GAS5对MPP+处理的SK-N-SH细胞活性和凋亡的影响。结论LncRNAGAS5通过靶向miR-128提高MPP+处理后SK-N-SH细胞活性,抑制细胞凋亡。LncRNAGAS5可能是成为PD的分子靶点。
帕金森病(PD)在60岁以上人群发病率约1%[1],是以运动迟缓、僵硬、姿势不稳和震颤为特征的神经退行性疾病[2]。建立PD模型细胞可研究PD发展的分子机制,为其治疗提供分子靶点。
研究表明,miRNA参与PD相关基因的表达调控,长链非编码RNA(LncRNA)参与PD的发病过程,miRNA和lncRNA可能是PD的潜在治疗靶点[3]。生长抑制特异性转录本(GAS)5在癌症中广泛存在,可抑制多种肿瘤的发生发展[4]。但目前GAS5对PD的影响还不清楚,需要进一步研究。本研究通过生物信息学预测发现,miR-128可能是GAS5的靶基因。研究发现miR-128在PD中起重要的作用,敲低miR-128表达小鼠可出现运动障碍表现[5]。本研究通过以1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(MPP+)处理SK-N-SH细胞24h的方式建立PD细胞模型,检测GAS5和miR-128对PD模型细胞活性和凋亡的影响。
1、材料与方法
1.1 材料
人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH购自ATCC;DMEM高糖培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司,MPP+、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma-Aldrich公司;B淋巴细胞瘤(Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体和抗GAPDH抗体购自上海碧云天生物科技有限公司;Real-timePCR试剂盒、反转录(RT)-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;总RNA提取试剂TRIzol和Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司;流式法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司;引物、GAS5过表达载体(pcDNA3.1-GAS5)、GAS5干扰物(si-GAS5)、miR-128模拟物(miR-128)、miR-128抑制剂(anti-miR-128)、阴性对照(miR-NC、si-NC、anti-miR-NC和pcDNA)、GAS5的野生型和突变型双荧光素酶载体购自上海吉玛基因;流式细胞仪购自美国BD公司,光学显微镜、全自动酶标仪、发光仪及Real-timePCR仪购自美国Bio-rad公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
将SK-N-SH细胞培养在含10%FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中,置于5%CO2、37℃培养箱中常规培养。待细胞生长融合成单层时,用胰蛋白酶消化传代。
1.2.2 PD细胞模型建立[6]
取对数生长期的SK-N-SH细胞进行模型建立。分为对照(Con)组:SK-N-SH细胞正常培养;MPP+组:培养液中加入终浓度为2.50mmol/L的MPP+,继续培养24h。MPP++转染组:加入终浓度为2.50mmol/L的MPP+培养24h后进行细胞转染。
1.2.3 细胞转染
将加入MPP+后培养24h的SK-N-SH细胞,稀释为1×106个细胞/ml,以每孔200μl(2×105个/孔)接种于6孔板中,待细胞生长融合成单层时按照Lipofectamine2000说明书进行转染。转染分组:GAS5抑制组(转染si-NC和si-GAS5),miR-128过表达组(转染miR-NC和miR-128),GAS5过表达组(转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-GAS5),GAS5和miR-128共抑制组(转染si-GAS5+anti-miR-NC和si-GAS5+anti-miR-128),GAS5野生型和突变型双荧光素酶报告系统(转染miR-NC+WT-GAS5、miR-128+WT-GAS5、miR-NC+MUT-GAS5和miR-128+MUT-GAS5),将各载体或片段转入MPP+处理24h的SK-N-SH细胞中,转染48h,收集细胞,进行后续实验。
1.2.4 Real-timePCR检测RNA的表达
收集MPP+处理和(或)转染后的各组SK-N-SH细胞,用TRIzol试剂提取细胞总RNA,然后按照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA,以cDNA为模板按照Real-timePCR的说明书进行反应合成miR-128和GAS5,反应程序为:94℃5min;94℃30s、60℃30s、72℃45s,40个循环;72℃5min。用2-ΔΔCt方法进行数据分析。
1.2.5 MTT法检测细胞活性
收集MPP+处理和(或)转染后的各组细胞,稀释后以2×103个细胞/孔接种于96孔板,在培养至24h、48h和72h时进行MTT实验,酶标仪检测每孔细胞的OD490nm(A)值。
1.2.6 流式细胞术测定细胞凋亡率
收集MPP+处理和(或)转染后的各组细胞,以每孔2×104个细胞接种于6孔板中培养48h,弃去培养液,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,按照流式法细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作,上流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.7 Western印迹检测蛋白表达
收集MPP+处理和(或)转染后的各组细胞,冰浴超声破碎细胞,离心收集蛋白,将蛋白样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后将蛋白条带转聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室温封闭2h,加入稀释的一抗(Bcl-2抗体1∶2000、Bax抗体1∶1000和GAPDH抗体1∶3000),4℃过夜孵育,PBST洗膜2次,加入稀释的酶标二抗,室温孵育1h,显影,以GAPDH为内参照,分析蛋白表达水平。
1.3 统计学处理
采用SPSS19.0软件进行方差分析、t检验。
2、结果
2.1 MPP+处理对SK-N-SH细胞的影响
与Con组相比,MPP+组处理的SK-N-SH细胞凋亡率显著升高,细胞中Bax表达显著升高,Bcl-2表达显著降低,细胞在24h、48h和72h的OD值均显著降低(均P<0.001),见图1、表1、图2。
2.2 GAS5、miR-128在MPP+处理的SK-N-SH细胞中的表达
与Con组相比,MPP+组处理的SK-N-SH细胞中GAS5含量显著升高,miR-128含量显著下降(均P<0.001),见表2。
2.3 抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH细胞活性及凋亡的影响
与MPP++si-NC组相比,MPP++si-GAS5组SK-N-SH细胞中GAS5和Bax表达显著下降,Bcl-2表达显著升高,细胞凋亡率显著下降,细胞OD值在24h、48h和72h均显著升高(均P<0.001),见表3、图3、图4。
2.4 GAS5靶向调控miR-128的表达
miR-128的中含有与GAS5互补的序列,见图5。与miR-NC组相比,过表达miR-128组野生型WT-GAS5的萤火虫荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05);而突变型MUT-GAS5的荧光素酶相对活性无显著变化。见表4。qRT-PCR结果表明,与pcDNA3.1组(1.01±0.10)相比,过表达GAS5可使miR-128含量显著下调(0.31±0.03,P<0.05);与si-NC组(1.03±0.10)相比,抑制GAS5表达可上调miR-128含量(1.62±0.16,P<0.05)。
2.5 过表达miR-128对MPP+处理的SK-N-SH细胞活性及凋亡的影响
与MPP++miR-NC组相比,MPP++miR-128组SK-N-SH细胞中miR-128和Bcl-2含量显著升高,Bax表达显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著降低,细胞OD值在24h、48h和72h均显著升高(均P<0.001),见图6、图7、表5。
2.6 抑制miR-128能逆转抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH细胞活性及凋亡的作用
与MPP++si-GAS5+anti-miR-NC组相比,MPP++si-GAS5+anti-miR-128组SK-N-SH细胞中GAS5和Bax蛋白表达显著升高(均P<0.001),miR-128和Bcl-2蛋白表达显著降低,细胞凋亡率显著升高,细胞OD值在24h、48h和72h均显著降低(均P<0.001),见表6、图8、图9。
3、讨论
PD影响着0.1%~0.2%的人类,是一种多因素导致的神经退行性疾病,导致运动功能减退,影响患者正常生活,且大多在神经元完全退化后期才被发现,缺乏早期诊断技术和后期治疗策略,发现其早期诊断标志物和后期治疗靶点是疾病研究的热点[7]。
越来越多的研究表明,lncRNA参与中枢神经系统基因表达调控不同的分子机制,调控从染色质重塑为主的神经干细胞分化到神经元活动,通过驱动不同的调控机制触发退行性神经死亡和病变[7]。LncRNAGAS5是GAS5,其通过调控细胞增殖、凋亡、细胞周期等生命过程,与心肌梗死、脑卒中、高血压等多种疾病的发生、发展及治疗密切相关[8],其在癌症中多异常表达,过表达GAS5可抑制多种肿瘤的发生发展[9]。但GAS5在神经系统疾病中的研究较少。最新研究表明,在大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞中,高表达GAS5能促进PC12细胞向Tuj1阳性神经元样细胞分化,显著抑制PC12细胞增殖和细胞周期,不影响PC12细胞的凋亡,提高胆碱乙酰转移酶的表达,促进胆碱的释放,GAS5可能有利于神经元和胆碱能神经系统的恢复[10]。GAS5在PD中的表达尚不清楚。本研究发现,GAS5在MPP+处理的SK-N-SH细胞(PD模型)中含量显著升高,MPP+可促进SK-N-SH细胞凋亡并抑制细胞活性,抑制GAS5可提高MPP+处理的SK-N-SH细胞活性并抑制细胞凋亡。说明,GAS可能在PD的发展过程中发挥重要作用。
本研究通过TargetScan预测发现,miR-128中含有与GAS5互补的序列,miR-128可能是GAS5的靶基因。miR-128在成年神经元中通过调节神经元信号网络和兴奋性来调节运动行为。在小鼠中,出生后神经元miR-128表达的减少可导致运动活动增加和致命的癫痫,miR-128的过度表达减弱了神经元的反应性,抑制了小鼠的运动活动,减轻了与PD和癫痫发作相关的运动异常[11]。在PD小鼠中,miR-128表达降低,其靶向负调控轴抑制蛋白(AXIN)1,高表达miR-128可抑制多巴胺神经元的凋亡并促进兴奋性氨基酸转运体(EAAT)4的表达[12]。本研究发现,miR-128在MPP+处理的SK-N-SH细胞(PD模型)中含量显著下降,高表达miR-128可提高MPP+处理的SK-N-SH细胞活性并抑制细胞凋亡,与上述结论[12]类似。双荧光素酶报告系统和qRT-PCR结果表明,GAS5靶向负调控miR-128的表达,抑制miR-128逆转了抑制GAS5对MPP+处理的SK-N-SH细胞活性和凋亡的影响,验证了最初的预测,在PD模型细胞中GAS5与miR-128之间具有调控关系。
综上,在MPP+处理的PD模型细胞SK-N-SH中,lncRNAGAS5通过靶向miR-128调控PD模型细胞活性和凋亡,提示GAS5和miR-128是可能PD治疗的潜在分子靶点。
参考文献:
[5]李杰.帕金森病中miR-128作用机制的研究[D].武汉:华中科技大学,2016.
[8]高少辉,徐金升.LncRNAGAS5与肾脏病发生关系[J].临床荟萃,2018;33(10):846-8.
[9]杨雨叶,朱月春.长链非编码RNAGAS5在肿瘤中的作用及其机制[J].生命的化学,2017,37(6):1049-55.
文章来源:欧诒丹,高元杰,陈静.GAS5靶向miR-128调控帕金森病模型细胞凋亡的分子机制[J].中国老年学杂志,2022,42(05):1178-1182.
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帕金森病(PD)是一种慢性神经系统退行性疾病,主要临床特征为肌强直、静止性震颤和运动迟缓等。中晚期PD普遍伴随有明显的步态异常和姿势不稳定,其中姿势不稳定多以脊柱变形、躯干倾斜和身体稳定性异常为主[1]。步态冻结(FOG)是PD进入中晚期阶段的最重要特征之一,可导致患者呈现出频繁性的跌倒、受伤甚至骨折[2]。
2024-04-14帕金森病(Parkinson's disease, PD)是中老年常见的神经退行性疾病,其病理表现主要为黑质及纹状体多巴胺能神经元丢失和路易小体形成[1]。PD常表现为震颤、运动迟缓和运动障碍等典型运动症状,也可表现为认知障碍、抑郁、睡眠障碍等非运动症状[1,2,3]。
2024-04-10帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界第二大中枢神经退行性疾病,在中老年人群中较常见,主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势障碍。这些运动症状与中脑的多巴胺(dopamine,DA)能神经元丢失密切相关。目前,左旋多巴(L-dopa)仍然是PD药物治疗的金标准,其可以有效补充PD患者体内的DA水平。
2024-04-10帕金森病是一种慢性进行性疾病,其典型运动症状是运动迟缓、僵硬和震颤。帕金森病的一项重要病理机制为中脑多巴胺能神经元丢失与变性。神经黑色素磁共振成像(NM-MRI)可以实现黑质致密(substantia nigrapars compacta, SNc)的良好可视化,有效观察帕金森病患者SNc对应的病理变化,因此NM-MRI被视为SNc多巴胺神经元功能或神经黑色素浓度的替代测量方法。
2024-04-09帕金森病(Parkinson disease,PD)是一种进行性神经退行性疾病,病理改变上涉及不同脑区和多个神经递质通路,这些通路与一系列临床特征相关。PD临床表现主要为运动迟缓、肌强直、静止性震颤、姿势平衡障碍等运动症状,常伴有认知障碍、自主神经功能障碍和睡眠障碍、精神障碍等非运动症状。
2024-04-03帕金森病(PD)常见的神经系统退行性疾病,是一种增龄性疾病,65岁以上的老年人的患病率大约为1.7%[1],随着年龄增长,患病人数逐渐增加[2]。通常认为PD是以复杂的运动症状为主要表现的运动障碍疾病,主要表现为运动迟缓、肢体僵硬、静止性震颤和姿势步态不稳。在过去的几十年中,帕金森病被确认为一种多层面的疾病,包括嗅觉减退、便秘、睡眠障碍、认知功能下降、自主神经功能紊乱、感觉异常等多种非运动症状。
2024-04-02帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常见的神经系统进行性退行性疾病,临床表现为运动迟缓、震颤、僵硬等运动症状,及以便秘、嗅觉缺失等为代表的非运动症状。PD 的主要病理变化是路易体(Lewy bodies, LBs)和路易神经元突起(Lewy neurites, LNs)的细胞内包涵体的聚集,以及致密部(Substantia nigra pars compacta, SNpc)的黑质多巴胺能(Dopamine, DA)神经元的丢失;
2024-03-30帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是常见的神经系统进行性退行性疾病,临床表现为运动迟缓、震颤、僵硬等运动症状,及以便秘、嗅觉缺失等为代表的非运动症状。PD 的主要病理变化是路易体(Lewy bodies, LBs)和路易神经元突起(Lewy neurites, LNs)的细胞内包涵体的聚集,以及致密部(Substantia nigra pars compacta, SNpc)的黑质多巴胺能(Dopamine, DA)神经元的丢失[1];对PD的进展病程,目前的治疗只能提供暂时的症状
2024-03-29如今,帕金森病是一种常见的老年退行性疾病,其发病机制较为复杂,但多数研究均认为其与多巴胺及锥体外系有关。其临床表现也可分为运动与非运动两大类,运动类症状以静止性震颤、行动迟缓为主,非运动症状则包括了认知障碍、焦虑抑郁、睡眠障碍、大小便异常等。虽然运动症状仍然是如今帕金森病的诊断核心,但非运动症状,特别是神经精神症状和体征在临床中均认为具有一定的相关性[1]。
2024-03-25帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是以中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死为主的中老年常见疾病。我国现有PD患者近300万例,预计到2030年我国PD患者数将达500万例,严重增加医疗负担。PD多样化的临床症状会加重患者疾病负担,导致患者出现多种情绪障碍,PD患者情绪障碍发病率约为健康人群的2倍,是影响其健康相关生活质量的独立危险因素。
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专业分类:医学
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