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SCO2介导乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移浸润的机制研究

2024-11-18 93 上传者：管理员

摘要：目的探究SCO2介导乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移浸润的机制。方法以乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为研究对象，通过瞬时转染干扰其SCO2并分为对照组（si-NC组）和干扰组（si-SCO2组），采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blotting检测SCO2干扰效果，通过往siSCO2组细胞加入正常MDA-MB231细胞分泌的小细胞外囊泡的方式挽救SCO2，并分为对照组（siNC组）、干扰组（si-SCO2组）和挽救组（si-SCO2+NC-sEVs组）；进一步构建SCO2过表达质粒并将质粒转染至细胞中并分为对照组（OENC组）和过表达组（OE-SCO2组），采用划痕试验和Transwell浸润试验分别检测各组迁移能力和侵袭能力。结果 si-SCO2组SCO2 mRNA、蛋白相对表达量均较si-NC组细胞低（P <0.05）。si-SCO2组细胞迁移率较si-NC组低（P <0.05），细胞侵袭数较si-NC组少（P <0.05）。si-SCO2组细胞迁移率较si-NC组低，细胞侵袭数较si-NC组少（P <0.05）,si-SCO2+NC-sEV组细胞侵袭数较si-SCO2组高（P <0.05）。OE-SCO2组SCO2 mRNA、蛋白相对表达量较OE-NC组高（P <0.05）。OE-SCO2组细胞迁移率较OE-SCO2组高（P <0.05），细胞侵袭数较OE-SCO2组多（P <0.05）。结论敲低SCO2能降低MDA-MB-231细胞的迁移能力和浸润能力，过表达SCO2可促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移能力和浸润能力，SCO2有望成为治疗乳腺癌转移的调控靶点。

关键词：
SCO2
乳腺癌
恶性肿瘤
调控靶点
迁移浸润
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乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一，其转移和侵袭是患者死亡的重要原因[1]。根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的癌症负担数据，乳腺癌已经取代肺癌成为全球第一大癌症[2]。因此，探讨乳腺癌转移的分子机制异常重要。SCO细胞色素氧化酶缺陷同源物2(SCO2）是参与线粒体电子传输链的COX-2组件的关键酶[3]。LEARY等[4]研究证实SCO2在调节细胞铜稳态中的作用。SCO2是一种p53依赖性代谢调节因子，通过调节呼吸途径和糖酵解途径之间的平衡，参与p53介导的能量代谢过程，而p53又通过增加SCO2的转录，维持氧化磷酸化以及线粒体呼吸[5]。SCO2突变常见于COX缺乏症病例，如心肌病、心脏肥大、神经病和Leigh综合征等[6-8]。然而关于SCO2对乳腺癌转移的影响报道较少。本研究探讨SCO2对乳腺癌细胞的影响，可为寻找乳腺癌的转移治疗靶点提供新视野。

1、材料与方法

1.1细胞与试剂

人乳腺癌MDA-MB-231细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司。胎牛血清、DMEM高糖培养基均购自美国Gibco公司，Transwell chamber（小室）和Matrigel基质胶均购自上海YEASEN公司，SCO2-si RNA干扰质粒购自江苏赛索飞生物科技有限公司，IP细胞裂解液购自上海碧云天生物技术股份有限公司，G250考马斯亮蓝购自江苏凯基生物技术股份有限公司，SCO2抗体购自美国CST公司，β-ACTIN抗体购自美国Proteintech公司，Lipo3000转染试剂购自美国Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

将本实验室冻存的细胞解冻复苏后，接种至含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，然后转移至37℃、5%二氧化碳孵箱中培养。

1.2.2细胞转染及分组

取对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，按照Lipo3000转染试剂说明书将si-NC、si-SCO2干扰序列和OE-NC、OE-SCO2过表达质粒瞬时转染至细胞中，24 h后转染完成。将si-NC、si-SCO2干扰序列转染至MDA-MB-231细胞，分为si-NC组和si-SCO2组，在实验组细胞加入正常MDA-MB-231细胞外囊泡并作为siSCO2+NC-s EV组；将SCO2过表达质粒转染至MDA-MB-231细胞，分为OE-NC组和OE-SCO2组。

1.2.3划痕试验计算细胞划痕愈合率

将MDA-MB-231接种于6孔板（1×104个细胞/孔），用20μL塑料移液管尖端创建划痕区域。用PBS洗涤细胞，重新培养与于无血清培养中，0和24 h后在相同位置成像，观察划痕愈合程度，计算细胞划痕愈合率，划痕愈合率=（d0 h-d24 h）/d0 h×100%。

1.2.4 Transwell迁移试验计算侵袭细胞数

将细胞消化离心后，沉淀重悬。将7.5×104个细胞加进已经铺好基质胶的上室中，再吸取600μL完全培养基加至下室中去。浸润板放于37℃培养箱中继续培养24～48 h，取出小室，小心拭去上室多余的细胞，4%多聚甲醛固定20 min,0.1%结晶紫染色10 min,PBS清洗后风干，镜下成像，计算侵袭细胞数。

1.2.5 Western blotting检测蛋白表达

细胞培养至80%左右密度时，弃培养基，并用PBS洗涤干净。后加入适量IP裂解液，置于冰上充分裂解20 min，然后在4℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液并测定蛋白浓度。平衡蛋白浓度后加热变性，每孔上样40μg蛋白，SDS-PAGE电泳2 h分离蛋白，冰上转膜1 h,5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h,4℃冰箱孵育一抗过夜。次日TBST洗膜3次，5 min/次，然后使用相对应的二抗稀释液（1∶15 000）室温孵育1 h，洗膜3次，5 min/次。最后使用红外荧光显影仪对PVDF膜显影。判断目的蛋白的条带位置，并根据其灰度值分析相对表达量。

1.2.6小细胞外囊泡的沉淀、富集

配置富集液：称取聚乙二醇粉末12 g、氯化钠4.5 g，补充dd H2O至50 m L。收集细胞上清液，并以上清液∶富集液=1∶2混匀置于4℃摇床快速摇晃12 h。然后在4℃温度下、4 522 r/min离心1 h，离心半径14 cm，弃上清液，取沉淀。加入适量PBS混匀，转移至1.5 m L离心管。

1.2.7实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测SCO2基因相对表达量

使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，然后逆转录成c DNA。SCO2正向引物：5'-CTC CACCAAACAGGTTGCC-3'，反向引物：5'-CTGCTCAG CCGATCTGCTC-3'，长度均20 bp;β-actin正向引物：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'，反向引物：5'-C TCCTTAATGTCACGCACGAT-3'，长度均21 bp。提取RNA样品后，使用20μL体系进行扩增反应。反应条件：94℃预变性5 min,55℃变性5 min,72℃退火15 s,72℃延伸30 s，共35个循环。采用2-ΔΔCt法计算SCO2基因相对表达量。

1.2.8过表达质粒提取

用接种环蘸取菌液接种到含琼脂的固体培养基中，放置在37℃孵箱中培养18 h，挑取合适的单个菌落，再将其接种至已经加了抗生素液体培养基中培养12 h，采用i Pure快速无内毒素质粒小提中量试剂盒提取过表达质粒，用于后续转染。

1.3统计学方法

数据分析采用Graphpad Prism 9.5统计软件。计量资料以均数±标准差表示，比较用t检验或方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1瞬时转染干扰MDA-MB-231细胞SCO2表达

si-SCO2组与si-NC组SCO2基因、蛋白相对表达量比较，经t检验，差异均有统计学意义（P<0.05),si-SCO2组均较si-NC组细胞低。见表1和图1。

表1 两组SCO2基因、蛋白相对表达量比较

图1 蛋白条带图

2.2 SCO2促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力

si-SCO2组与si-NC组细胞迁移率、细胞侵袭数比较，经t检验，差异均有统计学意义，（P<0.05),siSCO2组细胞迁移率较si-NC组低，细胞侵袭数较siNC组少。见表2和图2、3。

表2 两组细胞迁移率、细胞侵袭数比较

图2 si-NC组与si-SCO2组细胞迁移能力比较（×10)

图3 si-NC组与si-SCO2组细胞侵袭能力比较（×10)

2.3挽救SCO2恢复乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力

通过收集小细胞外囊泡的方式挽救SCO2，划痕实验结果显示，各组细胞迁移率、细胞侵袭数比较，经单因素方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05),si-SCO2组细胞迁移率较si-NC组低，细胞侵袭数较si-NC组少；si-SCO2+NC-s EV组细胞侵袭数较si SCO2组高。见和图4、5和表3。

图4 各组细胞侵袭能力比较（×10)

图5 各组细胞迁移能力比较（×10)

表3 各组迁移细胞率、侵袭细胞数比较

2.4 OE-NC组与OE-SCO2组SCO2基因、蛋白相对表达量比较

OE-NC组与OE-SCO2组SCO2基因、蛋白相对表达量比较，经t检验，差异均有统计学意义（P<0.05),OE-SCO2组较OE-NC组高。见表4和图6。

2.5过表达SCO2促进乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力

OE-NC组与OE-SCO2组细胞迁移率、细胞侵袭数比较，经单因素方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05),OE-SCO2组细胞迁移率较OE-SCO2组高，细胞侵袭数较OE-SCO2组多。见表5和图7、8。

表4 OE-NC组与OE-SCO2组SCO2基因、蛋白相对表达量比较

图6 蛋白条带图

表5 各组细胞迁移率、细胞侵袭数比较

图7 OE-NC组与OE-SCO2组细胞迁移能力比较（×10)

图8 OE-NC组与OE-SCO2组细胞侵袭能力比较（×10)

3、讨论

乳腺癌是女性群体中最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率顺位均位于我国女性恶性肿瘤前列[9]。随着社会进步与经济发展，人们的生活方式也随着工业化和城市化的到来而改变，因此也加重了女性的乳腺癌负担[10-11]。有研究显示，乳腺癌的发生与电离辐射等职业危害因素有关[12]。虽然通过早期筛查和一些临床治疗手段已让乳腺癌的防治取得了一定进展，但晚期患者的转移及复发导致的不良预后仍是临床上面临的巨大挑战[13]。因此，寻找乳腺癌治疗靶点并揭示其内在分子机制至关重要。

乳腺癌是一种异质性疾病，可分为Luminal A、Luminal B、HER2阳性和三阴性亚型[14]。据文献报道，20%～30%的乳腺癌患者会发生肿瘤转移，癌症相关性死亡归因于转移的大约有90%，无转移的乳腺癌患者5年总生存率>80%[15]，然而远处转移可使生存率大幅降低至约25%[16]。转移性乳腺癌患者的生存率普遍较低且生活质量差。肿瘤转移仍然是临床治疗的重大挑战，也是癌症死亡的主要原因[17]。目前的治疗方式仍然以内分泌、化疗及放射治疗为主[18]。由于缺少预测乳腺癌转移的分子标志物和高效的治疗靶点，转移性乳腺癌患者还不能得到有效的治疗。

SCO2是一种线粒体膜结合蛋白，参与铜供应，用于真核生物中细胞色素C氧化酶的组装[19]，其功能尚不完全清楚。SCO2蛋白作为COXⅣ的组装因子，参与COX亚基Ⅱ的生物合成，而COX亚基Ⅱ是COXⅣ的重要核心亚基[20]。此外，SCO2作为巯基二硫键氧化还原酶调节SCO1中半胱氨酸的氧化还原状态[21]。SCO2蛋白还参与线粒体氧化还原信号传导[22]和线粒体中的p53调控通路[5,23]。

目前有研究表明，SCO2参与一些疾病和癌症的发生、发展过程。如SCO2可以促进呼吸功能并保护神经胶质瘤和结肠癌细胞免受缺氧诱导的细胞死亡[8],SCO2在HCC组织中的基因表达显著高于其周围组织，与肝癌患者生存不良显著相关[24]，以及增加活性氧的产生，导致细胞凋亡信号调节激酶与其抑制剂氧化还原活性蛋白、硫氧还原蛋白之间形成的蛋白质复合物解离[25]。然而关于SCO2在癌转移中的研究报道较少。

本研究通过划痕实验、Transwell实验证明在MDA-MB-231细胞中敲低SCO2后，其迁移和侵袭能力降低，而通过收集小细胞外囊泡方式挽救SCO2后其迁移和侵袭能力得到恢复，进一步在MDA-MB-231细胞中过表达SCO2后，其迁移和侵袭能力提高。

综上所述，本研究证明SCO2可以促进乳腺癌细胞的迁移浸润，初步揭示SCO2在癌转移中的促进作用。但本研究的结果可能需要进一步的体内实验来证实，在未来的实验中，笔者将进一步阐明SCO2影响乳腺癌迁移浸润的具体机制。

参考文献:

[9]赫捷,陈万青,李霓,等.中国女性乳腺癌筛查与早诊早治指南(2021,北京)[J].中国肿瘤, 2021, 30(3):161-191.

[18]姚云祥,邵明海,蔡妙国. CT模拟机联合三维放射治疗计划系统在乳腺癌放射治疗中的应用效果[J].医疗装备, 2024,37(10):74-77.

基金资助:国家自然科学基金(No:32171408);

文章来源:潘强发,陈佳茹,蔡春青.SCO2介导乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移浸润的机制研究[J].中国现代医学杂志,2024,34(22):26-31.