乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，占所有癌症病例的30%,国际癌症研究机构(IARC)的数据显示，乳腺癌已经成为女性癌症相关死亡的主要原因[1]。三阴性乳腺癌(TNBC)作为乳腺癌中最具侵袭性的亚型，约占所有乳腺癌病例的15%～20%,而其引发的死亡占所有乳腺癌死亡的三分之一。在临床上，TNBC相比其他类型的乳腺癌复发风险高，无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)短，患者的术后5年死亡率为37%且50%的早期TNBC患者出现复发。此外，转移性TNBC患者在一线化疗失败后PFS很短，中位PFS为3至4个月[2]。针对TNBC目前尚无标准的治疗方案，研发有效的治疗药物来改善TNBC患者的预后具有重要意义。乳腺肿瘤干细胞(CSC)通过多种机制诱导乳腺癌的侵袭转移和对放化疗的治疗抵抗，导致肿瘤的复发。2019年初，FDA首次批准PD-L1(Atezolizumab)联合化疗用于治疗局部晚期或转移性PD-L1阳性的TNBC患者，免疫治疗显著改善了TNBC的疗效。然而，CSC可以通过多种机制逃脱免疫监视，因此对于CSC的免疫治疗仍然存在很大挑战。本文就TNBC的治疗及CSC在TNBC治疗耐药中的作用进行综述，评估了将CSC及相关信号通路作为TNBC治疗靶点的潜在价值。

1、TNBC的治疗现状

TNBC的疾病异质性和致癌因素的靶点缺乏是TNBC治疗所面对的重要挑战，其外科治疗和放射治疗选择的原则类似于其他亚型乳腺癌，而新辅助和辅助化疗适用于大小≥0.5cm或淋巴结阳性的早期TNBC患者。通常情况下，化疗方案的选择由肿瘤大小、淋巴结状况、分级、是否存在医学共病以及患者整体状况决定。然而，在转移性TNBC患者中，原发性和转移性病灶中ER、PR和HER-2的表达可能存在差异，发生率分别为12.6%、31.2%和5.5%。因此，当患者出现转移时应尽可能对转移性病灶进行确诊性活检[3]。

由于TNBC患者在化疗后通常无法实现病理完全缓解(pCR),因此针对不同亚型TNBC,化疗方案的选择一直存在争议。FDA批准的TNBC辅助和新辅助化疗方案包括紫杉类(紫杉醇、多西紫杉醇、白蛋白合成紫杉醇)、蒽环类(阿霉素、表阿霉素、各类脂质体阿霉素)、抗代谢类(卡培他滨、吉西他滨)等。在标准化疗中加入铂类化合物使TNBC患者的pCR率提高了一倍，但与其他亚型乳腺癌相比，未能实现pCR的患者的预后更差。与非TNBC亚型相比，以蒽环类为基础的新辅助化疗在TNBC中pCR较高[4]。PRADO等人应用概率图形模型从CSC假说的角度探索了TNBC的分型，分别从细胞和免疫两个独立的生物学水平对患者预后和治疗进行分层[5]。受分子和基因组表达的影响，不同分型的患者在接受相同治疗后的药物反应具有明显的异质性。最近，复旦大学上海肿瘤中心开展了一项Ⅰb/Ⅱ期临床研究(NCT03805399),对受试者进行500+基因检测和IHC亚型染色，评估特定亚型TNBC患者多种靶向治疗的疗效。

多项临床试验探究了TNBC对治疗反应的基因组效应，SILVER等[6]研究表明，启动子甲基化和p53突变引起的BRCA1表达的改变预示着患者对顺铂治疗具有良好的敏感性。此外，CD73的表达与TNBC患者对阿霉素的耐药性有关[7]。另一项基因组研究发现，TNBC中存在p53和PIK3CA的突变、MYC和HIF-1α表达的上调、细胞周期蛋白E1的扩增和PTEN及RB1的表达缺失。此外，有研究通过分析新辅助化疗后残留的TNBC组织发现了CDK4、MCL1、JAK2、AKT1和EGFR基因的扩增和BRCA1/2、ATM和CDKN2A的突变丢失。TNBC分子亚型的临床预后及治疗反应在很大程度上仍是不明确的，这些发现为后续的研究提供了新的思路。目前，TNBC的临床研究主要包括单药治疗或不同靶治疗试剂与化疗的联合治疗，这些靶点和治疗方法主要涉及DNA修复和损伤、生长因子和血管生成、特定激素受体和免疫检查点分子。

2、CSC与TNBC

2.1BCSC相关信号通路

乳腺癌干细胞(BCSC)相关信号通路主要包括Hedgehog、Wnt以及Notch通路，其参与调节细胞凋亡逃逸、维持干细胞稳态和增强侵袭能力。通路发生突变或异常激活时，增加了BCSC的异常增殖，诱导BCSC的治疗耐药，促进了乳腺癌的发生发展。

Hedgehog信号通路(Hh)参与调控和维持干细胞稳定，由Hh配体、细胞膜跨膜蛋白受体Ptch和Smo以及转录因子Glis(Gli1、Gli2、Gli3)三部分组成。Hh配体与跨膜蛋白受体Ptch1的结合刺激了Smo的活性，激活的Smo通过作用于Gli2和Gli3,诱导Gli1的转录，Gli1mRNA的表达提示Hh信号通路的激活。HUIM[8]等报道，在侵袭性导管癌中，Ptch1和Smo、Glis的表达水平与乳腺癌的增殖指数呈正相关，此外，Hh通路抑制剂可有效抑制BCSC的增殖[9]。

Wnt信号通路的活化通过干扰乳腺干细胞正常的自我更新过程，诱导其异常增殖及BCSC的形成，从而促进乳腺癌的发生发展。在BCSC中Wnt信号通路相关蛋白的表达较正常乳腺干细胞显著增高，抑制Wnt信号通路可以抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移[10],进一步证实Wnt信号通路对于维持BCSC的自我更新及静止状态具有重要的作用。

Notch信号通路有4种Notch受体(Notch1-4)和5种配体(DLL1、3、4以及Jagged1、Jagged2)。配体与受体结合，诱导受体裂解，裂解后的胞内成分与细胞核中的转录抑制因子结合，从而激活Notch靶基因的转录活性，这些基因的激活可诱导BCSC的过度增殖，抑制乳腺癌细胞的凋亡。研究证实Notch受体在BCSC中表达且通过Notch抗体可抑制Notch信号通路的转导[11]。

此外，其他信号转导通路，如PI3K/Akt/mTOR、Hippo信号通路和JAK2/STAT3也与BCSC的增殖相关。

2.2CSC比例升高与TNBC化疗耐药

由于CSC的干细胞特性、耐药性和免疫逃避，导致其难以被传统的治疗药物清除，从而促进了肿瘤复发和远处转移[12]。CSC具有两种细胞状态：静止CSC和增殖CSC,二者对抗有丝分裂药物的治疗反应存在显著差别。高剂量的抗有丝分裂药物可以杀死增殖状态的CSC,而静止的CSC仍能存活。研究证实，静止CSC在接受常规化疗后通过刺激生存信号诱导了肿瘤的复发。在实体肿瘤中，BCSC是最早被发现的，在免疫缺陷的NOD/SCID小鼠中接种极少量的BCSC便足以导致肿瘤的产生[13]。CD44/CD24和ALDH1的表达可以用来鉴定BCSC的分化程度，通过对466例乳腺浸润性癌和8种乳腺癌细胞系的分析发现，TNBC中存在比例最高的CSC表型为CD44+、CD24-和ALDH1阳性[14]。在临床上，这样的表型预示着较差的化疗反应、淋巴结转移、远处转移、复发以及较短的无病生存期(DFS)和OS[15,16]。其中，ALDH1的高表达是TNBC预后不良的一个独立预后因子。在TNBC患者中，一线化疗通过消除增殖细胞有效抑制了原发肿瘤的体积，但通常无法作用于CSC。

2.3CSC参与TNBC耐药的作用机制

治疗耐药是肿瘤治疗面临的一个持续挑战，是治疗失败的主要原因。对于CSC的耐药可分为两种类型：对治疗反应的获得性耐药；内在耐药，即对一系列药物的耐药[17,18]。多药耐药(MDR)是临床常见的广谱耐药现象，目前认为CSC参与了MDR的发生。

2.3.1CSC的微环境与TNBC耐药

CSC的微环境主要由癌相关成纤维细胞(CAF)、内皮细胞(ECs)、间充质干细胞(MSC)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和细胞外基质(ECM)组成，这些细胞能够分泌多种细胞因子和趋化因子，如IL6/IL8、CXCL12、CXCL7,通过激活CSC信号网络和NF-κB通路导致治疗抵抗[19,20]。研究表明，CAF增加了Ⅰ型胶原的分泌，降低了乳腺癌细胞株的药物摄取力。此外，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、神经胶质瘤中，CAF和免疫细胞之间的相互作用激活NF-κB信号诱发自我更新。CAF还能够通过RIG-1分泌外泌体，激活乳腺癌细胞中的STAT1,STAT1进一步激活Notch3,导致CSC耐药性增加[21,22]。ECs诱导乳腺癌中CXCL1/2的分泌，同时分泌TNFα激活NF-κB信号通路，该过程介导了免疫细胞趋化因子的产生，包括S100A8/9,从而诱导对阿霉素和环磷酰胺的化学耐药性。免疫细胞如TAMs通过多种生长因子、细胞因子和趋化因子与癌细胞相互作用[23]。ECM主要由成纤维细胞分泌的分子组成，实体肿瘤中增加的ECM构成了细胞与化疗药物之间得物理屏障，保护CSC不受化疗药物的影响。此外，ECM还可以与CSC相互作用，调节增殖信号通路以及耐药性。例如，在ECM中表达的肌腱蛋白C提高了Wnt和Notch信号通路的效能，从而促进了CSC的增殖及耐药的产生[24]。

2.3.2ABC蛋白与TNBC耐药

许多ATP结合盒式蛋白(ABC)表达于CSC表面，其通过ATP水解介导小分子化合物从胞质排出到细胞外介质。ABC转运蛋白能够转运多药耐药蛋白1(ABCB1)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP/ABCG2)诱导乳腺癌细胞的多药耐药性[25]。此外，值得注意的是，ABC转运蛋白的启动子具有上皮细胞-间充质转化(EMT)转录因子的结合位点。研究报道，在乳腺癌中ABCG2mRNA的表达与蒽环类药物的治疗反应之间存在相关性，这种相关性并不存在于接受环磷酰胺、甲氨蝶呤治疗的患者中。通过搜索GEOProfiles数据库发现，在5个紫杉醇耐药的TNBC细胞系中存在ABCB1的基因组突变(数据可访问NCBIGEO数据库，登录号为gse90564)。此外，ABCB1与Hedgehog通路之间的相互作用支持了CSC与ABC转运体之间的关系[26]。

2.3.3缺氧和ROS

CSC通常位于肿瘤的缺氧区域，低氧诱导因子-1α(HIF-1α)是调节氧稳态的核转录因子，在高氧水平泛素化降解。在氧含量低的环境中，HIF-1α激活并与HIF-1β形成二聚体，激活特定基因的转录[27],这些基因包括CSC应对缺氧环境的60多个基因，涉及多种细胞生物学活动，如细胞增殖和凋亡、血管生成、细胞代谢和pH值的平衡[28]。缺氧环境下的TNBC细胞中BCSC的比例的增加归因于HIF-1α的激活，且HIF-1α的激活与TNBC的转移率和死亡率增加有关。此外，HIF-1α的表达与乳腺癌的MDR相关，例如，阿霉素、紫杉醇或吉西他滨治疗TNBC时，HIF-1α的激活诱导了BCSC的聚集。HIF-1α的激活刺激了其他干细胞活化剂的表达，包括Wnt、Hedgehog、Notch通路以及干细胞标志物FOXA2、CD133、NANOG、SOX2、SOX17、PDX1[29,30]。在正常情况下，活性氧(ROS)的积累可以导致肿瘤细胞的凋亡，而HIF-1α信号可以减少ROS的产生，稳定干细胞的功能[31],导致耐药性的产生。ALDH1作为CSC的标志物，可以直接减少ROS,产生抗氧化化合物起到解毒作用，如NADP[32]。在乳腺癌中，ALDH1通过保护细胞免受紫杉醇等药物的损伤，诱导了细胞化疗耐药性。临床上，超过半数的TNBC患者存在ALDH1的表达，是TNBC患者预后不良的独立预后因子[33]。在接受新辅助化疗的234例患者中，ALDH1(+)组pCR率明显低于对照组(13.5%vs30.3%),且ALDH1(+)乳腺癌预后差，侵袭性强[34]。

2.3.4CSC的修复能力

在CD44+CD24-的TNBC中，CSC具有高度活跃的盘状结构域受体(DDR)信号，DNA单链断裂修复尤为活跃[35]。与相对分化程度较高的细胞相比，BCSC在基线和放射治疗后均表现出较低的DNA损伤水平。EZH2通过参与组蛋白甲基化，促进了BCSC的扩增。细胞周期调节基因和凋亡诱导基因的突变有助于CSC逃避凋亡。此外，通过抑制AKT1信号进而下调Wnt信号增加了BCSC的放疗敏感性。总的来说，DDR信号的抑制增加了CSC对DNA损伤的敏感性。

3、针对CSCs及其相关因子的治疗策略

3.1靶向CSC相关信号通路

目前进行的诸多临床试验以CSC相关信号通路为靶点，通过抑制干细胞的相关信号通路的活性来抑制CSC的增殖活化，增强CSC的药物敏感性，从而改善了患者的疗效。

3.1.1Hedgehoge信号通路抑制剂

Hh通路抑制剂包括针对Hh配体的Shh抗体、PRARbeta;Ptch抑制剂有Cur61414和5-FU;Smo抑制剂有vismodegib、cyclopamine、USA-smo5A、KAAD-cyclopamine、VitD3、SANT1-4、smo-siRNA;Gli抑制剂有Gli-siRNA、FGF、REN-KCTD11、Numb、PP2A,从不同层次抑制乳腺癌Hh信号通路的表达。例如：盐霉素通过抑制Ptch、Smo、Gli1及Gli2的表达，选择性杀伤乳腺癌微球体[36]。cyclopamine可与Smo中的七螺旋集束区结合，抑制细胞内信号转导，同时诱导癌变细胞凋亡，该药物已作为抗乳腺癌药物进入临床试验阶段[37]。此外，针对基底细胞癌的Ⅱ期临床研究(NCT-03035188)发现，与接受标准治疗的患者相比，vismodegib的使用改善了患者的中位生存期[38]。

3.1.2Wnt信号通路抑制剂

分泌型Fzd相关蛋白SFRP和Wnt抑制因子WIF与细胞膜上Wnt相关受体相结合，拮抗Wnt信号通路；单克隆抗体Wnt-1可以抑制Wnt配体与细胞膜受体的结合，引起Wnt通路下游蛋白改变，诱导BCSC的凋亡。通过运用RNA干扰技术和反义RNA来阻止细胞内信号的传导，有效抑制乳腺癌的生长。非甾体类抗炎药，如阿司匹林、消炎痛、舒林酸等通过下调乳腺癌干细胞中的β-catenin水平发挥抗乳腺癌作用。KAKARALA[39]等利用多酚针、姜黄素和胡椒来阻断Wnt通路，缩小了BCSC微球体的体积。Pyrvinium作为Wnt信号通路抑制剂，能明显减少BCSC的数量，抑制乳腺癌的发生发展[40]。

3.1.3Notch信号通路抑制剂

目前针对乳腺癌治疗的Notch单克隆抗体正在研发中，包括Notch1单抗(NRR1,GenentechandExelixis公司开发),Notch2单抗(NRR2,GenentechandExelixis公司开发)。γ-分泌酶抑制剂(GSI)能够有效的抑制Notch通路的活性，包括mk0752、pf-03084014和GSIMRK-003。SCHOTT[41]等发现多西他赛联合mk0752能够减少BCSC的数量、缩小乳腺癌体积，并抑制转移的发生。目前，mk0752与不同药物联合的临床试验正在进行中，例如，mk0752联合内分泌药物或化疗药物用于治疗乳腺癌[42]。此外，针对pf-03084014治疗晚期乳腺癌的Ⅰ期临床试验也在进行中。

3.1.4其他通路抑制剂

其他BCSC相关信号通路抑制剂包括：PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂雷帕霉素、LY294002、BKM120、哌立福辛；JAK2/STAT3通路抑制剂C188。最近的体外研究报道，对TNBC细胞系同时使用PI3K抑制剂及Wnt抑制剂起到协同作用，增强了抗增殖效果。

3.2调控CSC的休眠状态

休眠状态的CSC具有很强的药物抵抗，导致细胞毒性化疗药物的治疗无效。研究者们提出了几种药理策略：维持肿瘤细胞的休眠状态、激活休眠细胞、提高其对抗增殖药物的敏感性、消除休眠细胞。CDK4/6抑制剂介导细胞周期从G0/G1期向S期过渡，可诱导G0/G1细胞周期阻滞。目前，一些CDK4/6抑制剂的临床试验已经在TNBC中进行[43]。此外，PUIG等[44]人发现以TET2为靶点可使休眠细胞逆转为增殖细胞，降低耐药能力。YAN等人[45]在乳腺癌中证明，通过全反式维甲酸(ATRA)诱导晚期分化，使MDRMCF-7对表阿霉素治疗重新敏感。最后，在胰腺导管腺癌模型中，IGF-1R酪氨酸激酶抑制剂linsitinib通过消融K-RAS或c-MYC癌基因来消除休眠状态的癌细胞。这些药物的时间治疗顺序显示出更好的效果，而不是联合治疗，例如，在乳腺癌中，Src抑制剂只有紫杉醇后应用才能改善多西紫杉醇的疗效，而当两种药物同时使用时则不能。综上所述，维持或激活休眠状态的CSC可能是一个潜在的治疗策略。

3.3针对CSC的微环境

如上文所述，CSC所处的微环境对治疗耐药的产生具有重要意义，因此，针对CSC微环境也是一种具有潜力的策略。研究表明，通过靶向分泌EMT诱导因子的CAFs和TAMs,可以阻断EMT将非CSC重新编程为CSC的过程。此外，IFN-β治疗TNBC时能够抑制CSC的活性，减少EMT的表达和迁移的发生，促进上皮表型CD24的重新表达。研究发现，透明质酸的破坏导致基质减少和血管系统重新扩张，改善了动物胰腺癌模型的化疗疗效，证明了靶向ECM及其相关蛋白的潜力[46]。

3.4其他特殊药物

研究表明，使用氧化铁纳米颗粒将常规化疗药物靶向递送至CD44+细胞可以选择性杀伤BCSC。目前，开展了CD44靶向药物RO5429083用于治疗CD44阳性的实体瘤的Ⅰ期临床研究(NCT-01358903)。二甲双胍通常在临床上用于Ⅱ型糖尿病患者的治疗，现被证明通过抑制ABC转运蛋白的活性来降低BCSC的耐药性。SONNENBLICK等研究发现二甲双胍通过降解靶基因KLF5进而抑制下游靶基因NANOG和FGF-BP1的活化，从而减少了TNBC中的BCSC。目前，二甲双胍作为辅助治疗在临床试验中使用[47]。多西环素是FDA批准的一种抗生素，被发现可减少乳腺癌骨转移风险，且通过抑制线粒体功能来降低CSC对紫杉醇的耐药性[48],该临床研究正在进行(NCT01847976)。

4、总结与展望

TNBC是乳腺癌的异质亚型，通常缺乏有效的治疗靶点。CSC在TNBC的发生发展中起重要作用，与患者治疗耐药的产生存在密切联系。将BCSC作为治疗靶点，针对其相关信号通路、细胞稳态以及微环境研发有效的治疗药物是TNBC治疗的潜在策略。

文章来源：周静,杨岩,王静萱.肿瘤干细胞在三阴性乳腺癌治疗耐药中的作用及机制研究进展[J].现代肿瘤医学,2021,29(22):4063-4067