临床治疗中，通过科学、足量的放疗能够有效控制食管癌进展[1],但并非所有食管癌患者均对放疗敏感，部分患者因对放疗耐受而造成治疗失败，其影响因素包括患者自身特征、肿瘤本身、放射剂量效应关系等[2]。随着近年来基因检测技术的快速发展，通过基因检测预测食管癌患者对放疗的敏感性，并制定个体化放疗方案。相关研究[3]显示，DNA损伤修复能力与放疗敏感性密切相关，DNA损伤修复相关基因在其中发挥重要作用，其单核苷酸多态性(SNP)能够改变DNA修复蛋白功能，进而影响损伤修复能力。谷胱甘肽硫转移酶P1基因(GSTP1)、切除修复交叉互补基因1(ERCC1)在核苷酸修复中发挥重要作用[4]。为此，本研究主要探讨GSTP1和ERCC1基因多态性与食管癌患者放疗敏感性及预后的关系。

1、对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年4月—2020年2月徐州医科大学附属医院收治的食管癌患者200例。其中，男144例，女56例；年龄61～75岁，平均(66.31±5.08)岁。根据放疗结束后的疗效将患者分为放疗敏感组(完全缓解、部分缓解)、放疗不敏感组(稳定、进展)。本研究经徐州医科大学附属医院医学伦理委员会审核批准，患者均自愿参与并签署知情同意书。

入选标准：经内镜检查和病理检查确诊为食管癌；无放疗禁忌证，接受多西他赛单药化疗和同期放疗；完成3 a随访研究。

排除标准：有重要器官功能异常或癌细胞远处转移的患者；接受过手术治疗、放疗、化疗的患者。

1.2 方 法

1.2.1 治疗方案

食管癌患者放疗方案：采取适形放射治疗，总剂量为原发肿瘤靶区60 Gy, 2 Gy/次，1次/d, 5次/周，30次为1个疗程。放疗第1天开始同期进行化疗，化疗方案：多西他赛40 mg, 1次/周，6次为1个疗程，共2个疗程。

1.2.2 疗效评价

患者放疗1个疗程后，参照实体瘤疗效评价标准(RECIST1.1)判断食管癌患者的疗效，分为完全缓解、部分缓解、稳定、进展。其中，完全缓解：靶病灶完全消失；部分缓解：靶病灶最大径与治疗前相比减少30%及以上；稳定：处于部分缓解和进展之间的状态；进展：靶病灶最大径与治疗前相比增加20%及以上，或出现新发肿瘤病灶。将完全缓解、部分缓解纳入放疗敏感组，稳定、进展纳入放疗不敏感组。治疗后对患者进行3 a随访，利用电话、门诊复查、住院复查等方式进行，记录患者生存情况。

1.2.3 GSTP1和ERCC1基因型检测

采集患者外周静脉血4 mL,放入EDTA抗凝管中4 ℃保存待测，使用Qiagen全血基因组DNA提取试剂盒获得基因组DNA。PCR扩增引物由上海士锋生物有限公司合成。GSTP1上游引物：5′-AAAGTCCCCTCTTTAAAC CGC-3′,下游引物：5′-CTGACTGATGGAGTACTTGTT-3′;ERCC1上游引物：5′-CCGTCATTAGGCGGTCGGAA-3′,下游引物：5′-CTCATGTAGTGGTCGTC GTAG-3′。PCR反应体系20 μL,包括dNTP Master Mix 6 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DNA模板3 μL、双蒸馏水9 μL。扩增条件：94 ℃预变性1 min, 95 ℃变性40 s, 60 ℃复性1 min, 共45个循环，72 ℃延伸5 min。检测仪器自带软件收集荧光信号并分析得出SNP分型，同时将标本送至基因科技(上海)股份有限公司进行直接测序。

1.2.4 MBP-1、PTEN、Cyclin D1、PLCE1基因表达检测

取适量的患者食管癌组织，加入RIPA蛋白裂解液充分研磨，将组织悬液以12 000 r/min 4 ℃恒温离心15 min, 收集上清液；应用酶联免疫吸附法测定髓磷脂碱性蛋白1(MBP-1)、磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)、G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1)、磷脂酶Cε1(PLCE1)基因蛋白浓度。

1.3 统计学分析

应用SPSS 25.0对数据进行处理与统计学分析。本研究中计量资料均符合正态分布，以均数±标准差(ˉx±s)表示，两组间比较用t检验；计数资料以n(η/%)表示，P<0.05为差异具有统计学意义；基因分布情况进行Hardy-Weinberg平衡定律检验，P>0.05为Hardy-Weinberg平衡。

2、结 果

2.1 不同性别、病理类型的食管癌患者GSTP1和ERCC1基因多态性分析

本研究结果显示，200例食管癌患者中GSTP1基因携带野生型GG 115例，杂合型GA 61例，突变型AA 24例。ERCC1基因携带野生型CC 86例，杂合型CT 99例，突变型TT 15例。GSTP1和ERCC1基因SNP分布符合Hardy-Weinberg平衡，GSTP1和ERCC1基因各位点的基因型分布在不同性别、病理类型的食管癌患者间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同性别、病理类型的食管癌患者GSTP1和ERCC1基因多态性分析

2.2 GSTP1和ERCC1基因型与食管癌患者放疗后疗效分析

本研究结果显示，200例食管癌患者经放疗后敏感(完全缓解、部分缓解)119例纳入放疗敏感组，不敏感(稳定、进展)81例纳入放疗不敏感组。GSTP1基因携带杂合型GA和突变型AA的食管癌患者放疗后完全缓解、部分缓解的比例明显高于野生型GG的患者，稳定、进展的比例明显低于野生型GG的患者(P<0.001)。ERCC1基因携带野生型CC的食管癌患者放疗后完全缓解、部分缓解的比例明显高于携带杂合型CT和突变型TT的患者，稳定、进展的比例明显低于携带杂合型CT和突变型TT的患者(P<0.001)。见表2。

表2 GSTP1和ERCC1基因型与食管癌患者放疗后疗效分析

2.3 GSTP1和ERCC1基因型与食管癌患者放疗后生存时间的关系

本研究结果显示，GSTP1基因携带杂合型GA和突变型AA的食管癌患者放疗后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明显高于野生型GG的患者(P<0.05);ERCC1基因携带野生型CC的食管癌患者放疗后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明显高于携带杂合型CT和突变型TT的患者(P<0.05)。见表3。

表3 GSTP1和ERCC1基因型与食管癌患者放疗后生存时间的关系

2.4 不同放疗敏感性的食管癌组织中增殖、凋亡相关基因表达

本研究结果显示，放疗不敏感组食管癌患者凋亡相关基因MBP-1、PTEN表达水平明显低于放疗敏感组食管癌患者，增殖相关基因Cyclin D1、PLCE1表达水平明显高于放疗敏感组食管癌患者(P<0.05)。见表4。

表4 不同放疗敏感性的食管癌组织中增殖、凋亡相关基因表达

2.5 GSTP1和ERCC1基因型与食管癌组织中增殖、凋亡相关基因表达水平的关系分析

本研究结果显示，GSTP1基因携带杂合型GA和突变型AA的食管癌患者凋亡相关基因MBP-1、PTEN表达水平明显高于野生型GG的患者，增殖相关基因Cyclin D1、PLCE1表达水平明显低于野生型GG的患者(P<0.001)。ERCC1基因携带野生型CC的食管癌患者凋亡相关基因MBP-1、PTEN表达水平明显高于携带杂合型CT和突变型TT的患者，增殖相关基因Cyclin D1、PLCE1表达水平明显低于携带杂合型CT和突变型TT的患者(P<0.05)。见表5。

表5 GSTP1和ERCC1基因型与食管癌组织中增殖、凋亡相关基因的关系分析

3、讨 论

放射生物学效应主要是通过DNA改变来实现的，当人体细胞在X线作用下会发生单链或双链断裂，其中双链断裂主要发生在对侧互补碱基对或间隔区碱基对[5]。DNA双链断裂是目前公认的电离辐射所致染色体损伤，主要修复方式为切除修复[6]。近年来研究[7]显示，恶性肿瘤患者放疗的疗效差异可能与DNA损伤修复水平有关。在恶性肿瘤患者分次放疗中，射线能够对DNA造成累积性损伤，该损伤过程在多种DNA底物及修复酶的作用下持续被修复，当患者对放疗中射线所致DNA损伤修复能力较强时，表现为放疗敏感性低[8]。GSTP1是从哺乳动物中分离得到的影响细胞对电离辐射敏感性的基因，参与DNA的修复过程，其编码蛋白无直接催化活性，但能够在碱基切除修复过程中发挥蛋白支架作用，与DNA连接酶作用后参与电离辐射所致的DNA修复和碱基损伤过程[9]。相关研究[10]显示，GSTP1基因G28152A位点多态性能够降低GSTP1基因的碱基切除活性，影响肿瘤细胞对放射性的敏感性。本研究对GSTP1基因G28152A位点多态性进行检测，结果显示，携带杂合型GA和突变型AA的食管癌患者放疗后完全缓解的比例明显高于野生型GG的患者，放化疗后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明显高于野生型GG的患者。提示食管癌患者中GSTP1基因携带杂合型GA和突变型AA的放疗效果更好，生存率处于较高水平；检测GSTP1基因SNP可作为食管癌患者放疗敏感性的预测指标之一。

ERCC1编码一种高度保守的单链DNA内切酶，其表达产物与相应的DNA切除修复酶通过互补基因相互结合而生成XPF-ERCC1核酸酶复合体，作为特异性核酸内切酶，发挥损伤识别、切除DNA 5′端的双重作用[11]。ERCC1基因C118T位点核苷酸C向T改变，会造成密码子中AAC排列转变为AAT,虽然上述两种核苷酸排列均编码天门冬氨酸，但SNP会改进基因转录[12]。相关研究[13]显示，卵巢癌细胞中ERCC1基因第121位密码子由C变异为T,造成ERCC1蛋白表达下调。目前，关于ERCC1基因多态性与食管癌放疗疗效的相关研究较少，为此，本研究对ERCC1基因C118T位点多态性进行检测，结果显示：ERCC1基因携带野生型CC的食管癌患者放疗后完全缓解的比例明显高于携带杂合型CT和突变型TT的患者，放疗后1 a生存率、2 a生存率、3 a生存率均明显高于携带杂合型CT和突变型TT的患者。提示食管癌患者中ERCC1基因携带野生型CC的放疗效果更好，生存率处于较高水平；检测ERCC1基因SNP也可作为食管癌患者放疗敏感性的预测指标。

放疗能够促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，凋亡、增殖相关基因的表达也会发生相应改变[14]。食管癌病情发展过程中MBP-1、PTEN属于凋亡相关基因，Cyclin D1、PLCE1属于增殖相关基因[15]。其中MBP-1作为c-myc启动子结合蛋白，可抑制其生物学活性，诱导细胞凋亡[16];PTEN负调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路，抑制该信号通路介导的细胞生长[17]。Cyclin D1属于细胞周期家族成员，具有高度保守性，其可通过调控细胞周期蛋白依赖性激酶来促进细胞增殖[18]。PLCE1可通过诱导抑癌基因p53活化来促进肿瘤细胞增殖[19]。本研究结果显示，放疗不敏感组食管癌患者凋亡相关基因MBP-1、PTEN表达水平明显低于放疗敏感组食管癌患者，增殖相关基因Cyclin D1、PLCE1表达水平明显高于放疗敏感组食管癌患者，提示MBP-1、PTEN、Cyclin D1、PLCE1表达水平与食管癌放疗敏感性密切相关。进一步分析显示，GSTP1基因携带杂合型GA和突变型AA的食管癌患者凋亡相关基因MBP-1、PTEN表达水平明显高于野生型GG的患者，增殖相关基因Cyclin D1、PLCE1表达水平明显低于野生型GG的患者。ERCC1基因携带野生型CC的食管癌患者凋亡相关基因MBP-1、PTEN表达水平明显高于携带杂合型CT和突变型TT的患者，增殖相关基因Cyclin D1、PLCE1表达水平明显低于携带杂合型CT和突变型TT的患者。说明GSTP1基因携带杂合型GA和突变型AA,ERCC1基因携带野生型CC可能通过上调凋亡相关基因MBP-1、PTEN表达，下调增殖相关基因Cyclin D1、PLCE1表达来发挥抑制食管癌病情发展的作用，具有较高的放疗敏感性。

综上所述，食管癌患者GSTP1和ERCC1基因SNP可作为放疗敏感性的预测指标，其中GSTP1基因携带杂合型GA和突变型AA,ERCC1基因携带野生型CC的患者放疗预后较好，可能与上调凋亡相关基因MBP-1、PTEN表达，下调增殖相关基因Cyclin D1、PLCE1表达有关。

参考文献:

[1]汪盛,王彩莲,范丽华.老年食管癌患者三维适形放疗后发生放射性肺炎与剂量体积参数的相关性[J].肿瘤防治研究,2021,48(2):173-177.

[2]刘小龙,庞皓文,杨波.胸中段食管癌术后不同布野方案对调强放疗剂量分布的影响[J].中国医疗设备,2021,36(2):46-49,57.

[5]张延军,王凯,马瑞,等.食管癌三维适形调强放疗过程中肿瘤区的移位及体积变化对其受照剂量的影响研究[J].实用医院临床杂志,2021,18(1):15-19.

[6]龙恩,游冬玲,徐鹏,等.食管癌放疗相关敏感基因研究进展[J].肿瘤预防与治疗,2022,35(1):73-80.

[7]胡杨静,贡鸣.食管癌患者营养状况对放疗预后的影响[J].中国卫生工程学,2020,19(6):951-952,955.

[9]陈劲松,林富,朱双根,等.谷胱甘肽S-转移酶P-1基因遗传变异对接受替莫唑胺联合放疗的脑胶质瘤患者预后的影响[J].肿瘤预防与治疗,2019,32(10):859-865.

[10]梁延杰,张沛,杜乐辉,等.谷胱甘肽S-转移酶P1对小鼠肺癌细胞放射敏感性调控作用[J].中华放射肿瘤学杂志,2021,30(5):498-502.

[12]淳彩璞,朱劲松,连文勇,等.ERCC1和XRCC1基因多态性与食管鳞癌发病及接受三维适形放疗疗效的关系[J].临床肿瘤学杂志,2015(10):894-901.

[14]张强,吴邵雅,张靖.放疗对肿瘤微环境的重塑及增强免疫治疗疗效机制的研究进展[J].肿瘤防治研究,2021,48(1):1-6.

[15]李原野,郭明洲.CXCL14基因甲基化是食管癌的潜在诊断标志物[J].胃肠病学和肝病学杂志,2021,30(12):1321-1324.

[16]党志成,章龙珍.基于免疫基因组学构建食管癌的预后风险模型[J].徐州医科大学学报,2021,41(8):547-553.

[17]韩晓亮.食管癌诊断､分期和预后中多肿瘤抑制基因-1､分泌素-3A1的表达研究[J].四川生理科学杂志,2021,43(3):370-373.

[18]钟灿新,张世豪.IPCL分型联合Cyclin D1､PDGFR对食管早期肿瘤的诊断和预后预测价值[J].河北医科大学学报,2021,42(8):891-895.

[19]韩文杰,李伟艳,何章彪.GSTP1和 PLCE1基因多态性与原发性食管癌的相关性研究 [J].中华医学遗传学杂志,2022,39(11):1283-1289.

基金资助:江苏省级学科带头人项目(DTRB202011);

文章来源:李强虎,辛勇.GSTP1和ERCC1基因多态性与食管癌患者放疗敏感性及预后的关系[J].北华大学学报(自然科学版),2024,25(01):60-65.