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黄芪多糖对糖尿病肾病小鼠肾组织血管内皮损伤影响

2023-11-20 6 上传者：管理员

摘要：目的观察黄芪多糖(APS)对KK-Ay小鼠肾组织血管内皮损伤的影响。方法将C57BL/6J小鼠设为空白组，将KK-Ay小鼠通过喂养高脂高糖饲料建立糖尿病肾病模型，造模后随机分为模型组、对照组(25 mg·kg-1厄贝沙坦灌胃)和低、中、高实验剂量组(100、200、400 mg·kg-1APS灌胃),每日灌胃1次，连续4周。给药干预4周后，心脏取血。用免疫组织化学染色方法测定小鼠肾组织中内皮素-1(ET-1)、血管性血友病因子(vWF)的蛋白表达水平；用蛋白质印迹法分析小鼠肾组织中NT蛋白的表达水平；用实时荧光定量聚合酶链反应法检测小鼠肾组织中SUR亚基2B/内整流钾离子通道亚单位6.1(SUR2B/Kir6.1) mRNA的表达水平。结果空白组、模型组、对照组和低、中、高剂量实验组小鼠的ET-1蛋白表达水平分别为0.25±0.05、0.43±0.02、0.28±0.06、0.39±0.01、0.34±0.03和0.30±0.02;vWF蛋白表达水平分别为0.24±0.04、0.35±0.02、0.26±0.03、0.34±0.03、0.30±0.03和0.28±0.02;NT蛋白表达水平分别为1.00±0.03、1.67±0.06、1.05±0.05、1.39±0.08、1.37±0.07和1.14±0.05;SUR2B mRNA表达水平分别为1.00±0.02、0.18±0.01、0.83±0.02、0.29±0.01、0.46±0.02和0.63±0.02;Kir6.1 mRNA表达水平分别为1.00±0.03、0.13±0.02、0.74±0.02、0.21±0.02、0.33±0.05和0.51±0.02。对照组、高剂量实验组上述指标与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论黄芪多糖能够改善DN小鼠肾组织血管内皮损伤，保护微血管结构与功能，延缓DN病情进展。

关键词：
KATP通道
KK-Ay小鼠
SUR亚基2B/内整流钾离子通道亚单位6.1 mRNA
糖尿病肾病
黄芪多糖
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糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病并发症中微血管病变的一个重要分支[1]。DN的具体发病机制与血流动力学异常、氧化应激等有关[2]。有研究表明SUR亚基2B(sulfonylurea receptor 2B,SUR2B)/内整流钾离子通道亚单位6.1(inward rectifyimg potassium channel 6.1, Kir6.1)亚型ATP敏感性钾离子(ATP-sensitive potassium channels, KATP)通道处于开放状态时，促进机体生成大量一氧化氮(nitric oxide, NO)并释放，抑制内皮素-1(endothelin-1, ET-1)高表达，改善血管内皮受损，保护血管内皮功能[3]。黄芪多糖(astragalus polysaccharides, APS)有较强的抗氧化损伤和保护血管内皮细胞的功能，可以清除自由基，抵抗血管损伤[4]。本课题组通过研究黄芪多糖对KK-Ay小鼠肾组织相关因子的影响，探讨其在糖尿病肾病微血管病变方面的作用。

一、材料与方法

1 实验材料

动物10～12周龄SPF级雄性KK-Ay小鼠50只，10～12周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠10只，购自北京华阜康生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2019-0008。本实验经甘肃中医药大学动物实验伦理会批准(编号：2021-368)。

药品与试剂黄芪多糖，规格：每瓶1 g, 纯度：98.15%,批号：CY210720,由陕西省西安市杨凌慈缘生物技术有限公司生产；厄贝沙坦片，规格：每片75 mg, 批号：210129,批准文号：国药准字H20000545,由安徽环球药业股份有限公司生产。SYBR Green Pro Taq HS预混型实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)试剂盒，购自中国Accurate Biotechnology公司；硝基酪氨酸(nitrotyrosine, NT)抗体，购自英国Abcam公司；血管性血友病因子(vascular hemophilic factor, vWF)抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司；内皮素-1(endothelin-1,ET-1)抗体，购自沈阳万类生物科技有限公司。

仪器DYCZ-40G Western blot转膜仪，北京六一生物科技公司产品；iMark酶标仪，美国Bio Rad公司产品。

2 实验方法

2.1 模型建立[5]5]

所有小鼠适应性喂养1周，C57BL/6J小鼠喂养普通饲料，KK-Ay小鼠喂养华阜康公司生产的KK鼠高脂高糖饲料进行诱导，测平均随机血糖≥13.9 mmo·L-1,证明糖尿病肾病模型构建成功。

2.2 动物分组与给药方法

小鼠按随机血糖随机分为6组，其中8只C57BL/6J小鼠为空白组，40只KKAy小鼠分为模型组、对照组和低、中、高剂量实验组，每组8只。对照组灌胃25 mg·kg-1厄贝沙坦；低、中、高剂量实验组分别灌胃100、200、400 mg·kg-1黄芪多糖，每日1次，连续4周。

2.3 样本采集

灌胃4周后，禁食12 h, 心脏采血，分离血清，-20 ℃保存。取肾组织，根据不同检测方法，分别置于4%多聚甲醛固定和液氮储存，备检。

2.4 肾组织病理学检查[6]6]

取出的肾标本固定后用石蜡包埋，切成厚度为3 μm的切片，经苏木精染色后用蒸馏水稍洗，用1%的盐酸乙醇2 min, 水洗2 min; 用饱和碳酸锂返蓝，30 s; 用0.5%伊红液染色，水洗2 min, 依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液当中各25 min, 观察肾组织形态学变化。

2.5 用qPCR检测SUR2B和Kri6.1 mRNA的表达[7]7]

采用qPCR进行组织总RNA提取，经过浓度测定及去DNA后，通过两步法合成cDNA,于PCR扩增仪上进行反转录及PCR反应，每个样本均设3个复孔，取均值。获得平均Ct值，按照2-ΔΔCt计算肾组织SUR2B和Kri6.1 mRNA的表达变化。

2.6 用蛋白质印迹法检测NT蛋白表达[8]8]

取肾组织，加入RIPA组织裂解液。根据蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。经变性、电泳、封闭、室温孵育1 h后进行显影，并用Image J软件分析灰度值。

2.7 用免疫组化法检测ET-1、vWF蛋白表达[9]9]

取肾组织石蜡切片，脱蜡、水化，柠檬酸钠热修复2次，3%H2O2孵育15 min, 血清37 ℃封闭30 min, 滴加ET-1、vWF抗体(1∶100),4 ℃孵育过夜，37 ℃复苏后，滴加二抗，37 ℃孵育30 min, 滴加三抗，37 ℃孵育30 min, DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。每张切片在高倍镜视野(×200)下随机选择10个肾小球和10个肾小管-间质区，曝光后用Image J进行分析。

3 统计学处理

用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验分析，当出现方差不齐时用Dunnett’s方法分析。

二、结果

1 黄芪多糖对KK-Ay小鼠肾组织形态的影响

小鼠随机分为6组，其中C57BL/6J小鼠为空白组；KKAy小鼠分为模型组(高脂高糖饲料)、对照组(灌胃25 mg·kg-1厄贝沙坦)和低、中、高剂量实验组(分别灌胃100、200、400 mg·kg-1黄芪多糖)。与空白组相比，经过干预4周后的其余5组小鼠肾组织均可见部分肾小管上皮细胞脱落、部分上皮细胞空泡变性，甚者出现肾小管上皮空泡化，肾间质可见部分淋巴细胞和单核细胞浸润，动脉管壁可见增厚。肾小球可见多处炎症细胞浸润，肾小球系膜明显增生。与模型组相比，对照组、高剂量实验组小鼠的肾病理改变明显减轻，见图1。

图1 各组小鼠肾组织病理变化(×200)

2 黄芪多糖对肾组织SUR2B和Kri6.1 mRNA的影响

模型组与空白组比较，小鼠肾组织中SUR2B与Kri6.1 mRNA表达水平均明显下降，差异均有统计学意义(均P<0.01);对照组、低、中、高剂量实验组与模型组比较，小鼠肾组织中SUR2B与Kri6.1 mRNA表达水平均显著增高，差异均有统计学意义(均P<0.01),见表1。

3 黄芪多糖对NT蛋白表达的影响

空白组、模型组、对照组和低、中、高剂量实验组小鼠的NT蛋白相对表达水平分别为1.00±0.03、1.67±0.06、1.05±0.05、1.39±0.08、1.37±0.07和1.14±0.05。模型组与空白组比较，小鼠肾NT蛋白表达水平显著升高(P<0.01);对照组和低、中、高剂量实验组与模型组比较，小鼠肾NT蛋白表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

表1 黄芪多糖对肾组织SUR2B和Kri6.1 mRNA的影响(x¯±s)

4 黄芪多糖对KK-Ay小鼠肾组织ET-1、vWF表达的影响

空白组、模型组、对照组和低、中、高剂量实验组小鼠的ET-1蛋白相对表达水平分别为0.25±0.05、0.43±0.02、0.28±0.06、0.39±0.01、0.34±0.03和0.30±0.02。模型组、对照组和低、中、高剂量实验组与空白组小鼠相比，小鼠ET-1表达均显著增强，差异均有统计学意义(均P<0.01);对照组和中、高剂量实验组与模型组比较，ET-1的表达均显著减弱，差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。

空白组、模型组、对照组和低、中、高剂量实验组小鼠的vWF蛋白相对表达水平分别为0.24±0.04、0.35±0.02、0.26±0.03、0.34±0.03、0.30±0.03和0.28±0.02。模型组与空白组比较，小鼠vWF表达显著增强，差异有统计学意义(P<0.01);对照组和中、高剂量实验组与模型组比较，小鼠vWF表达均显著减弱，差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。

三、讨论

DN的病机多为气阴两虚、痰瘀互结，属“消渴”范畴，中医多称其为“肾消”等[4]。《神农本草经》中记载黄芪味甘、性温，归脾肺经，可益气升阳，利尿消肿[10]。APS作为黄芪的有效成分，APS具有极强的免疫调节的作用，研究表明，APS可以防治多种疾病，具有抗氧化的作用[11],是天然的抗氧化剂天然的抗氧化剂[12]。文献表明，NO是维持血管内皮舒张功能的重要因子，由血管内皮细胞产生并释放，APS能够促进内皮细胞中NO的产生和释放，进而发挥改善血管内皮损伤，维持血管内皮功能的作用[13]。

本研究发现DN小鼠肾血管内皮损伤与NO-ONOO-途径介导的氧化应激关系密切，ET-1、vWF、NT作为该途径的标志蛋白，其表达在DN小鼠肾血管内皮细胞受到氧化应激的损伤时明显升高。同时还发现，当肾受损时，内皮细胞中的SUR2B/Kir6.1亚型KATP通道表达改变。APS通过调节SUR2B/Kir6.1mRNA的表达水平，调控肾组织中钾离子稳态以及促进NO的释放以保障血管张力的维持，同时能够降低机体血糖水平，通过降低NT蛋白以及血管内皮中ET-1、vWF的表达水平，干预NO-ONOO-氧化应激途径，降低应激损伤，维持DN小鼠肾血管内皮的结构与功能的生理状态，保护DN小鼠肾功能，延缓DN病情进展。

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