视网膜负责感应来自外界的光信号,并将这些光信号转换为生物电信号以形成视觉[1]｡近年来,人眼睛接触过度､强劲､人造照明的频率和持续时间逐渐增加,长期暴露于强光下可导致视网膜光化学损伤(RPD)[2]｡RPD病理机制主要是光氧化应激诱导感光细胞发生凋亡,目前感光细胞损伤的防治手段有限[3]｡因此,探索保护视功能的有效手段,减缓感光细胞凋亡进程是目前眼科界亟须研究解决的重要问题｡铁死亡是一种以铁积累和活性氧(ROS)增多为特征的新型细胞死亡形式,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1是一种人工合成的抗氧化剂,通过还原机制可防止ROS积累和膜脂损伤,抑制细胞死亡[4]｡研究显示,抑制铁死亡可降低高糖诱导的视网膜色素上皮细胞炎症和氧化应激,提高细胞活性,减轻细胞损伤[5]｡还有研究表明,Ferrostatin-1可减轻光照射引起的铁下垂,降低炎症和氧化应激,改善光照射引起的视网膜结构损伤和功能下降[6]｡Ferrostatin-1可减轻光照射引起的RPD,但其具体作用机制目前尚不十分明确｡跨膜受体蛋白(Notch)信号通路是传递细胞信号的一种通路,参与调控细胞增殖和凋亡过程｡研究显示,抑制Notch信号通路可减轻光化学诱导的视网膜静脉阻塞大鼠的视网膜损伤[7],以及降低糖尿病视网膜病变小鼠的血管生成和细胞凋亡,减轻视网膜组织损伤[8]｡推测Notch信号通路参与了视网膜组织损伤进展｡基于此,本研究通过建立RPD大鼠模型探讨Ferrostatin-1是否可通过调控Notch通路来减轻RPD大鼠感光细胞的凋亡,为相关研究提供理论基础｡

1､材料与方法

1.1实验动物

SPF级SD雄性大鼠60只,体重200~220g,购自珠海百试通生物科技有限公司,生产许可证号:SCXK(粤)2020-0051｡适应性饲养7d,自由取食和饮水,饲养环境条件:温度(22±2)℃,湿度(60±5)%,12h光-暗光照循环｡本研究已获成都医学院医学伦理批准[批准号:成医动伦(2024)第091号]｡

1.2主要试剂与仪器

Ferrostatin-1购自武汉博欧特生物科技有限公司;Jagged1/FC嵌合蛋白(Notch通路激活剂)-JFC购自美国MCE公司;亚铁离子(Fe2+)､乳酸脱氢酶(LDH)､丙二醛(MDA)､谷胱甘肽(GSH)､ROS试剂盒均购自成上海江莱生物科技有限公司;苏木精-伊红(HE)染色试剂盒购自上海祖联生物科技有限公司;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)染色试剂盒购自上海连桥生物科技有限公司;蛋白提取试剂盒和BCA试剂盒购自上海炎熙生物科技有限公司;转铁蛋白受体1(TfR1)､二价金属转运蛋白1(DMT1)､核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)､溶质载体家族7成员11(SLC7A11)､谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)､裂解的半胱氨酸蛋白酶-3(cleavedCaspase-3)､Notch､Split多毛增强子1(Hes1)､β-肌动蛋白(β-actin)一抗及二抗(ab214039､ab55735､ab313825､ab300667､ab252833､ab214430､ab300527､ab181366､ab115777､ab302644)均购自英国Abcam公司｡VMM4200显微镜购自苏州麦格仪器有限公司;YD-1900冷冻切片机购自浙江聚能仪器设备有限公司｡

1.3方法

1.3.1分组造模与给药

将大鼠随机分为Control组､RPD组､Ferrostatin1组､Ferrostatin-1+JFC组,每组15只｡RPD大鼠模型的建立步骤:用2mm厚的无色透明有机玻璃制作一个20cm的正方体光照箱,RPD模型大鼠均在12h明(光照强度30~50lux)及12h暗循环光环境适应10d,然后给予大鼠光照强度3000Lux的光照,持续照射24h[11]｡Control组大鼠不进行强光照射｡各组大鼠于造模前3d给药,Ferrostatin-1组大鼠腹腔注射Ferrostatin-1(5mg·kg-1)[9],Ferrostatin-1+JFC组大鼠腹腔注射Ferrostatin-1(5mg·kg-1)并灌胃JFC(0.5mg·kg-1)[10]｡Control组和RPD组大鼠使用同方式给予等体积生理盐水｡

1.3.2 HE染色观察大鼠视网膜形态变化造模

3d后,各组分别选取5只大鼠麻醉后颈椎脱臼法处死,摘取眼球,使用40g·L-1多聚甲醛固定,脱水后石蜡包埋,4μm厚度切片,脱蜡,梯度乙醇脱水,清洗,HE染色,透明,采用中性树胶封片,拍照观察视网膜形态,每个样本取5个视野,并测量视神经轴400μm处的外核层厚度｡

1.3.3 TUNEL染色检测

大鼠感光细胞凋亡取1.2.2中视网膜组织石蜡切片,脱蜡至水,胰蛋白酶处理消化组织,清洗,脱水,过氧化氢封闭15min,按照TUNEL试剂盒说明加入TUNEL混合液､converter-POD液,DAB显色剂相继进行反应,清洗脱水､二甲苯透明,最后中性树胶封片,拍照后采用Image-ProPlus6.0分析凋亡细胞,细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%｡

1.3.4检测大鼠视网膜组织

Fe2+､LDH､MDA､GSH､ROS表达水平将剩余大鼠麻醉后处死,摘取眼球,于4℃冰生理盐水中剪开角巩膜缘,弃去眼前节及玻璃体,外翻眼球壁,解剖显微镜下剥离视网膜组织,匀浆后低温离心机3000r·min-1离心10min,按照试剂盒说明依次加入Fe2+､LDH､MDA､GSH､ROS试剂盒中相应的反应试剂和终止试剂,测定吸光度值,计算相应指标水平｡

1.3.5 Westernblot检测大鼠视网膜组织中TfR1､DMT1､Nrf2､SLC7A11､GPX4､cleavedCaspase-3､Notch､Hes1蛋白表达水平

称取1.2.4中大鼠视网膜组织,加入裂解液,低温研磨匀浆,试剂盒提取组织总蛋白,定量分析蛋白含量,热水浴将蛋白变性,将10μL样品加入电泳槽进行电泳(起始电压80V,之后改为120V),电泳后转至PVDF膜,于体积分数5%脱脂奶粉中封闭2h,加入TfR1､DMT1､Nrf2､SLC7A11､GPX4､cleavedCaspase3､Notch､Hes1､β-actin(1:1500)兔抗4℃孵育过夜,清洗后二抗(1:5000)孵育2h,ECL显色,Image-ProPlus6.0分析各蛋白灰度值｡

1.4统计学处理

采用GraphpadPrism8.0.1进行统计分析,以均数±标准差表示计量数据,多组间比较用单因素方差分析,组内两两比较采用SNK-q检验｡检验水准:α=0.05｡

2､结果

2.1 Ferrostatin-1对大鼠视网膜形态变化的影响

Control组､RPD组､Ferrostatin-1组以及Ferrostatin-1+JFC组大鼠视网膜外核层厚度分别为(35.24±1.76)μm､(16.83±1.14)μm､(27.56±1.39)μm以及(21.48±1.23)μm｡Control组大鼠视网膜组织结构清晰;RPD组大鼠视网膜组织各层细胞排列疏松,视网膜外核层厚度明显变薄,感光细胞固缩明显被破坏,与Control组大鼠视网膜外核层厚度相比,差异有统计学意义(P<0.05);Ferrostatin-1组大鼠视网膜组织形态有明显改善,视网膜外核层厚度明显增厚,与RPD组大鼠外核层厚度相比,差异有统计学意义(P<0.05);与Ferrostatin-1组相比,Ferrostatin-1+JFC组大鼠视网膜组织损伤程度明显加重,视网膜外核层厚度明显变薄,差异有统计学意义(P<0.05)(图1)

图1 HE染色观察各组大鼠视网膜组

2.2对大鼠视网膜感光细胞凋亡的影响

Control组､RPD组､Ferrostatin-1组以及Ferrostatin-1+JFC组大鼠视网膜感光细胞凋亡率分别为(1.32±0.07)%､(18.57±1.63)%､(9.61±1.04)%以及(15.43±1.38)%｡RPD组大鼠视网膜感光细胞凋亡率高于Control组,Ferrostatin-1组大鼠视网膜感光细胞凋亡率低于RPD组,Ferrostatin-1+JFC组大鼠视网膜感光细胞凋亡率高于Ferrostatin-1组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图2)｡

图2 TUNEL染色观察各组大鼠视网膜感光细胞凋亡情况(×400)

2.3 Ferrostatin-1对大鼠Fe2+､MDA､LDH､GSH以及ROS表达水平的影响

RPD组大鼠Fe2+､MDA､LDH以及ROS表达水平均高于Control组,GSH表达水平低于Control组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);Ferrostatin-1组大鼠Fe2+､MDA､LDH以及ROS表达水平均低于RPD组,GSH表达水平高于RPD组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);Ferrostatin-1+JFC组大鼠Fe2+､MDA､LDH以及ROS表达水平均高于Ferrostatin-1组,GSH表达水平低于Ferrostatin-1组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1)｡

表1各组大鼠Fe2+､MDA､LDH､GSH以及ROS表达水平

2.4 Ferrostatin-1对大鼠视网膜组织中TfR1､DMT1､Nrf2､SLC7A11以及GPX4蛋白表达水平的影响

RPD组大鼠TfR1和DMT1蛋白相对表达水平均高于Control组,Nrf2､SLC7A11以及GPX4蛋白相对表达水平均低于Control组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);Ferrostatin-1组大鼠TfR1和DMT1蛋白相对表达水平均低于RPD组,Nrf2､SLC7A11以及GPX4蛋白相对表达水平均高于RPD组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);Ferrostatin-1+JFC组大鼠TfR1和DMT1蛋白相对表达水平均高于Ferrostatin-1组,Nrf2､SLC7A11以及GPX4蛋白相对表达水平均低于Ferrostatin-1组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3､表2)｡

图3 Westernblot检测各组大鼠视网膜组织中TfR1､DMT1､Nrf2､SLC7A11以及GPX4蛋白表达条带图

表2各组大鼠视网膜组织中TfR1､DMT1､Nrf2､SLC7A11以及GPX4蛋白相对表达

2.5 Ferrostatin-1对大鼠视网膜组织cleavedCaspase-3､Notch-1以及Hes1蛋白表达水平的影响

RPD组大鼠cleavedCaspase-3､Notch以及Hes1蛋白相对表达水平均高于Control组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);Ferrostatin-1组大鼠cleavedCaspase-3､Notch以及Hes1蛋白相对表达水平均低于RPD组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);Ferrostatin-1+JFC组大鼠cleavedCaspase-3､Notch以及Hes1蛋白相对表达水平均高于Ferrostatin-1组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图4､表3｡

图4 Westernblot检测各组大鼠视网膜组织中cleavedCaspase-3､Notch以及Hes1蛋白表达条带图

表3各组大鼠视网膜组织中cleavedCaspase-3､Notch以及Hes1蛋白相对表达

3､讨论

视网膜变性类眼病(RD)是以感光细胞进行性凋亡为特征的退行性疾病[12]｡视网膜是激光损伤的主要靶器官,显示器､智能手机以及电脑等光源可产生较高的光化学能,光子具有足够的能量产生光氧化应激,造成感光细胞氧化损伤和凋亡,引起视网膜组织严重损害[13]｡多年来,大量医学工作者一直把降低视网膜感光细胞凋亡作为预防和治疗视网膜变性眼病的核心研究｡目前,已开发出药物治疗､基因治疗以及视网膜假体等多种治疗手段｡但是,现代医学在光感受器细胞的保护和治疗措施方面仍有不足[14]｡因此,急需开发新的技术手段来减轻感光细胞凋亡以防治RD进展｡铁死亡是细胞在小分子物质诱导下发生的氧化性细胞死亡,Ferrostatin-1可降低ROS积累和氧化应激,降低细胞死亡｡Liu等[15]研究显示,Ferrostatin-1可抑制早产儿视网膜病小鼠脂质过氧化､氧化应激､铁下垂以及病理性血管的生成｡Chen等[16]研究显示,Ferrostatin-1可减轻视网膜变性小鼠氧化应激､铁下垂､光感受细胞变性和视网膜色素上皮萎缩｡因此推测Ferrostatin-1对视网膜组织有一定的保护作用｡光辐射可造成视网膜光感受器细胞和色素上皮细胞损伤,促进视网膜退化,进而引起视力降低[1]｡本研究结果显示,与Control组相比,RPD组大鼠视网膜组织各层细胞排列疏松,感光细胞固缩明显被破坏,视网膜外核层厚度明显变薄,提示造模成功｡Ferrostatin-1干预后可减轻大鼠视网膜组织损伤,提高视网膜外核层厚度｡视网膜感光细胞凋亡是引起RD的重要因素,cleavedCaspase-3是一种细胞凋亡蛋白,可启动细胞凋亡程序,激活激酶级联反应,促进细胞凋亡蛋白表达和细胞凋亡[17]｡本研究结果显示,Ferrostatin-1治疗后可降低大鼠视网膜组织中cleavedCaspase-3蛋白的表达,TUNEL实验也进一步证实了Ferrostatin-1可降低大鼠视网膜感光细胞的凋亡｡傅晓颍等[18]研究显示,RD患者视网膜色素上皮铁含量明显增加,视网膜铁过载可加重RD进展｡铁过量可催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化,从而诱导细胞铁死亡｡该过程会导致MDA和铁代谢衍生的致死性ROS的积累,还可以诱导细胞膜结构破坏使其释放LDH[19];铁稳态是细胞铁死亡的关键因素,铁离子主要与TfR1结合进入细胞,通过DMT1进入细胞质,然后储存于细胞内,进而诱导细胞铁死亡[18]｡本研究结果显示,与Control组相比,RPD组大鼠视网膜组织中Fe2+､MDA､LDH以及ROS表达水平均升高,TfR1与DMT1蛋白表达亦增加｡Ferrostatin-1治疗后可逆转上述指标,抑制铁离子进入细胞,减轻细胞铁死亡｡GPX4和SLC7A11是铁死亡的关键蛋白,Nrf2是一种调控抗氧化应激的关键转录因子,可调控GPX4和SLC7A11的表达;GSH是一种重要的抗氧化物质,其合成减少,可导致抗氧化防御酶GPX4的活性降低,进而造成脂质过氧化物胞内积累,最终引起

原,降低过氧化物酶反应,抑制ROS和MDA的积累,降低铁死亡;SLC7A11是GSH合成半胱氨酸的主要来源,可促进GSH合成[20]｡本研究结果显示,与Control组相比,RPD组大鼠视网膜组织中GSH､Nrf2､SLC7A11以及GPX4蛋白表达水平均降低｡Ferrostatin-1治疗后可逆转上述指标,降低铁死亡,提示Ferrostatin-1可降低RPD大鼠氧化应激､细胞铁死亡以及感光细胞凋亡,进而减轻视网膜组织损伤｡Notch是一条细胞之间信号转导的通路,Notch信号通路被激活后,可进入细胞核,招募转录辅助调节因子进一步激活其下游靶基因Hes1的转录,进而参与调节细胞的增殖和凋亡过程[21]｡Sahu等[22]研究表明,抑制Notch通路可促进视网膜患者的祖细胞增殖,减轻视网膜损伤｡Fogerty等[23]研究表明,抑制Notch通路可增强感光细胞再生,促进视力恢复｡本研究结果显示,与Control组相比,RPD组大鼠视网膜组织中Notch和Hes1蛋白表达水平均升高,Notch通路被激活｡Ferrostatin-1治疗后可降低Notch与Hes1的蛋白表达水平,抑制Notch通路｡为进一步验证Ferrostatin-1的作用靶点,本研究在Ferrostatin-1干预的同时,使用Notch通路激活剂JFC进行干预,结果显示,JFC可减弱Ferrostatin-1对RPD大鼠感光细胞凋亡的改善作用,提示Ferrostatin-1可能通过抑制Notch通路来改善RPD大鼠的感光细胞凋亡｡但Ferrostatin-1改善RPD是否与剂量有关目前尚不明确,后续还将设置不同浓度Ferrostatin-1进行进一步研究

4、结论

Ferrostatin-1可能通过抑制Notch通路降低RPD大鼠视网膜氧化应激和感光细胞凋亡,进而减轻视网膜组织损伤｡

参考文献:

[2]贾茜钰,叶河江,祁玉麟,陈婕.针刺调控感光细胞凋亡大鼠视网膜JAK2及STAT3表达作用机制[J].中华中医药杂志,2021,36(2):711-714.

[5]张进,贾爱华,高岩,刘承秀,梁涛.铁死亡在高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤中的作用及机制[J].国际眼科杂志,2023,23(6):894-899.

[7]韩莎莎,张贺鹏,李跃峰.玻璃体腔注射TA对光化学诱导大鼠BRVO模型血管生成及Notch通路的影响[J].国际眼科杂志,2020,20(6):951-955.

[9]宋沛,徐子桐,李林,衣卓,刁玉刚.铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在心肺转流大鼠认知功能中的作用[J].临床麻醉学杂志,2023,39(8):852-857.

[10]陈蓓,连李斌.丹皮酚抑制Notch1/Jagged1信号通路对妊娠糖尿病大鼠糖代谢紊乱的改善作用[J].河北医药,2023,45(11):1632-1636.

[11]姚向超,王延东,梁光江,唐细兰.黄斑明目颗粒对光化学损伤大鼠视网膜的保护作用[J].中药材,2012,35(6):961-963.

[14]吴家虞.金露梅水提物对视网膜光感受器细胞凋亡的保护及其分子机制研究[D].西宁:青海师范大学,2024.

[18]傅晓颖,邓晓敏,陈倩云,彭佳媛,杜旌畅,朱彦锋,等.飞燕草素对光诱导小鼠视网膜感光细胞661W铁过载的调控作用[J].眼科新进展,2021,41(7):615-620.

基金资助:国家自然科学基金项目(编号:81773432);

文章来源:李雯雯,王瀚生,宗师淼,等.铁死亡抑制剂对大鼠视网膜光化学损伤感光细胞凋亡和Notch通路的影响[J].眼科新进展,2025,45(06):429-434.