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塞内卡病毒分离株CH2016全基因组序列研究

2020-12-04 235 上传者：管理员

摘要：为了解塞内卡病毒分离株SVA/CH/ZZ/2016全基因组序列，设计4对相互重叠的特异性引物扩增基因片段，将扩增产物分别克隆至pCE2TA/Blunt-Zero载体并进行测序，拼接校正后获得SVA/CH/ZZ/2016株全基因组。结果显示，该毒株基因组全长7292bp，包括5'UTR（670bp）、ORF（6546bp）以及3'UTR（76bp）。选择国内外其他9株参考毒株序列，对编码区12个基因的核苷酸及编码氨基酸进行比对。结果显示，核苷酸同源性最高的是3B基因，最低的是VP1基因，其余基因的核苷酸序列同源性均在85.2%100%之间。VP1基因遗传进化分析显示，SVA/CH/ZZ/2016株与美国分离株USAIL＿Purdue＿43＿2016和USAIN＿Purdue＿3698＿2016株亲缘关系最近，属同一进化分支，与原始毒株SVV-001株亲缘关系最远。对SVA/CH/ZZ/2016株和原始毒株SVV-001VP1蛋白的氨基酸序列进行比对，发现共有10处氨基酸差异。本研究通过对SVA/CH/ZZ/2016株全基因组测序及分析，为进一步开展SVA分子生物学研究及流行病学调查提供了基础数据。

关键词：
全基因组
塞内卡病毒
序列分析
流行病学
猪传染病
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塞内卡病毒（SenecavirusA,SVA）是近年来新发现的猪传染病，猪感染后出现厌食、嗜睡、体温升高等症状，随后鼻镜部、口腔上皮、蹄冠部出现水泡样病变，与口蹄疫、猪水疱病和水泡性口炎临床症状相似[1]。2002年，美国研究人员从PER.C6（人胚胎视网膜细胞）细胞系中偶然分离出该病毒，并命名为SVV-001[2]。加拿大研究人员于2007年首次报道在猪群中分离到该病毒，当时并不能确定其是否具有致病性[3]。2016年，赵晓亚等[4]在我国首次分离出该病毒，将其命名为SVV/CH/01/2015。2016年，Qian等[5]从出现水泡症状的仔猪膀胱病变组织样本中分离并鉴定了一株SVA(SVA/HB/CH/2016）。2015—2017年，该病在各地猪群中呈现一定的流行，对我国养猪业造成了严重危害[6,7,8,9]。2019年，张志等[10]从健康猪体内采集10份SVA阳性样品，接种BHK-21细胞成功分离出2株SVA病毒，说明健康猪体内也携带SVA。

SVA为单股、正链、不分节段的RNA病毒，属于小RNA病毒科、塞内卡病毒属。病毒结构为正二十面体，直径约为27nm。病毒基因组全长约为7.3kb，包括5'端非编码区（5'UTR),1个大的开放阅读框（ORF）和3'端非编码区（3'UTR),3'UTR后有一段Poly(A）尾。ORF编码1个多聚蛋白，可分为12个多肽，构成标准的小RNA病毒科L-4-3-4模式[11]。2016年，金宇保灵生物药品有限公司从河南省郑州市某疑似感染猪病料中分离到1株SVA，将其命名为SVA/CH/ZZ/2016。本研究对该毒株进行全基因组序列测定及遗传进化分析，以期为进一步研究SVA致病机制以及研发疫苗、诊断试剂提供数据支持。

1、材料与方法

1.1毒株与细胞

SVA/CH/ZZ/2016株，由金宇保灵生物药品有限公司分离并保存；PK-15猪肾传代细胞，由金宇保灵生物药品有限公司保存。

1.2参考毒株

用于同源性比较的部分SVA参考毒株包括：SVV-001(GenBank:DQ641257）、SVA-CH-01-2015(GenBank:KT321458）、SVA-Colombia-2016(GenBank:KX857728）、SVA-CH-FuJ-2017(GenBank:MH490944）、SVA-HB-CH-2016(GenBank:KX377924）、SVV-HN16(GenBank:MF893200）、SVA-KS15-01(GenBank:KX019804）、SVA-CH-LX-01-2016(GenBank:KX751946）、HLJ-CHA-2016(GenBank:KY419132）。

1.3主要试剂

RNA提取试剂盒AxyprepTMBodyFluidViralDNA/RNAMiniprepkit，购自AXYGEN公司；5minTA/Blunt-ZeroCloningKit克隆载体、反转录试剂盒HiScriptII1stStrandcDNASynthesisKit，购自南京诺唯赞生物科技公司；KODOneTMPCRMasterMix高保真酶，购自东洋纺生物科技有限公司；胶回收试剂盒TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0、DNAMarker5000，购自大连宝生物公司。

1.4仪器与设备

生物安全柜、PCR仪、高速冷冻离心机、核酸电泳仪、紫外凝胶成像系统、干式恒温器、摇床等，均由金宇保灵生物药品有限公司提供。

1.5引物设计

根据NCBI发布的SVA参考序列SVA-CH-01-2015(GenBank:KT321458.1）、SVV-001(GenBank:DQ641257）、SVA-HLJ-CHA-2016(GeneBank:KY419132.1），应用DNAstar软件进行分析和比对，根据其保守区域设计4对特异性引物扩增SVA/CH/ZZ/2016株全基因组序列。引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1引物序列信息

1.6病毒RNA提取及反转录

取感染SVA/CH/ZZ/2016毒株的PK-15细胞，用RNA提取试剂盒提取总RNA，并反转录合成cDNA。反转录体系：Randomhexamers(50ng/µL)2μL、总RNA2μL、RNase-freeddH2O4μL。反转录过程：65℃加热5min，迅速置于冰上静置2min；加入2×RTmix10μL、HiScriptIIEnzymeMix2μL，然后依次25℃孵育5min、50℃孵育45min、85℃孵育2min。反应结束后，产物置于-20℃保存备用。

1.7PCR扩增

PCR反应体系：KODOneTMPCRMasterMix25μL、上下游引物（10μmol/L）各1.5μL、cDNA模板2μL、灭菌水20μL，共计50μL。PCR反应程序为：98℃变性10s,60℃退火5s、68℃延伸30s，共25个循环。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.8PCR产物克隆测序

参照TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0胶回收试剂盒说明书回收PCR产物。将回收产物与5minTA/Blunt-ZeroCloningKit克隆载体进行连接，连接体系为5×TA/BluntZeroCloningMix1μL、纯化PCR产物4μL。置于室温连接5min后，将连接产物转化至JM109感受态细胞，然后使用含氨苄抗性的培养基筛选阳性菌落；取单个菌落置于含氨苄抗性的LB液体培养基过夜培养，最后吸取菌液进行PCR鉴定（参照1.7步骤）。对PCR检测阳性的菌液提取质粒并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.9全基因序列拼接及组成分析

使用DNAstar软件包SeqMan软件，对4条测序结果进行拼接，获得SVA/CH/ZZ/2016株病毒全基因组序列信息，并参考Joshi等[12]的关于SVA序列分析方法进行分析。

2、结果

2.1SVA/CH/ZZ/2016株全基因扩增

将提取的总RNA逆转录合成cDNA，用特异性引物进行扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，均扩增出了相应的特异性条带（图1），与预期结果一致。

图1SVA/CH/ZZ/2016全基因组1～4片段PCR扩增结果

M.DL5000DNAMarker;1～4.SVA/CH/ZZ/2016第1～4片段基因。

2.2全基因序列拼接及分析

将4片段基因测序结果进行拼接矫正后获得SVA/CH/ZZ/2016毒株全基因组序列。结果显示，SVA/CH/ZZ/2016病毒基因组核酸序列全长7292bp,GC含量为52%。病毒基因组可分为3个区：5'UTR（全长670bp）、ORF（全长6546bp）以及3'UTR（全长76bp）。ORF编码一个含有2181个氨基酸的多聚蛋白。编码区结构包含L、P1、P2、P34个基因，L基因长度为237bp(671～907bp);P1基因编码病毒的衣壳蛋白，又分为VP4、VP2、VP3、VP14个基因，长度分别为213bp(908～1120bp）、852bp(1121～1972bp）、717bp(1973～2689bp）、792bp(2690～3481bp);P2基因分为2A、2B、2C3个基因，长度分别为27bp(3482～3508bp）、384bp(3509～3892bp）、966bp(3893～4858bp);P3基因包含3A、3B、3C、3D4个基因，长度分别为234bp(4895～5128bp）、69bp(5129～5197bp）、630bp(5198～5827bp）、1386bp(5828～7213bp）。

2.3编码区基因同源性分析

使用DNAstar软件包中MegAlign软件，对SVA/CH/ZZ/2016株与国内外8株参考毒株编码区核苷酸以及氨基酸同源性进行比较。结果（表2）显示，L基因的核苷酸同源性为97.0%～99.2%,VP4基因为95.8%～98.9%,VP2基因为94.2%～98.1%,VP3基因为92.6%～98.9%,VP1基因在90.9%～98.5%之间，2A基因在85.2%～100%之间，2B基因为93.2%～99.2%,2C基因为92.9%～98.4%,3A基因为91.9%～99.3%,3B基因为97.1%～100%,3C基因为92.5%～98.3%,3D基因为95.4%～98.6%。从总体上看，结构蛋白基因P1的核苷酸同源性低于非结构蛋白基因P2和P3。而P1中VP4基因同源性较高，VP1基因同源性较低，说明VP1基因是结构蛋白中变异最大的基因。

2.4SVA/CH/ZZ/2016株VP1基因系统进化树分析

VP1基因系统进化树分析结果（图2）显示，SVA/CH/ZZ/2016株和美国分离株SVA-USAIL＿Purdue＿43＿2016、SVA-USAIN＿Purdue＿3698＿2016进化距离最近，属于同一进化类群，而与2016年中国其余分离株、巴西分离株、加拿大分离株、泰国分离株有一定差异。SVA/CH/ZZ/2016株和原始毒株SVV-001进化距离最远，存在较大差异。

2.5VP1蛋白氨基酸差异比较

使用MegAlign软件对SVA/CH/ZZ/2016株和原始毒株SVV-001VP1蛋白的氨基酸序列进行比对，分析蛋白中的差异氨基酸，发现共有10处差异，位置及差异情况见表3。

表2SVA/CH/ZZ/2016与参考株核苷酸以及氨基酸同源性比较

注：括号内数据为氨基酸的同源性。

图2SVA各毒株VP1基因遗传进化树分析结果

表3SVV-001与SVA/CH/ZZ/2016株VP1蛋白氨基酸变异情况

3、讨论

感染SVA的新生仔猪有很高的死亡率，因此SVA严重影响着养猪业的发展[13,14]。有分析[15]表明，VP4蛋白是衣壳蛋白中的保守区域，可能位于衣壳蛋白内部。其突变则主要发生在VP1、VP2、VP3蛋白中，这些蛋白构成了病毒的主要衣壳蛋白。对结构蛋白变异情况进行分析，可为亚单位疫苗研发提供重要数据支撑。VP1结构蛋白是SVA的主要抗原，与SVA的细胞嗜性具有重要关系，编码的蛋白在受体结合中起重要作用，因此VP1基因比对分析对了解SVA遗传进化和病毒致病性变化具有重要意义[16]。最初分离的SVV-001株对猪无致病性，而近些年分离的毒株对猪有很强的致病性，说明SVA在不断变异。本研究对SVA/CH/ZZ/2016株和SVV-001株VP1基因推导氨基酸进行比对，共发现有10处氨基酸发生变异，这些氨基酸位点的突变很可能会改变细胞嗜性，从而增强SVA的致病性。SVA非结构蛋白区域可参与相关蛋白质加工，而相对结构蛋白为保守区域，因此可针对保守区非结构蛋白设计特异性引物，用来建立快速检测方法。樊晓旭等[17]在SVA病毒保守的3D基因区域，设计TaqMan探针以及特异性引物，建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法，用于病毒早期检测。本研究对SVA/CH/ZZ/2016株与9株参考毒株的非结构区域进行比对，发现3B基因相似度为100%,3B基因编码连锁蛋白VPg，可作为病毒RNA合成的引物。据文献[18]报道，在研发口蹄疫疫苗时，为了区别疫苗毒株和野生型毒株，在非结构蛋白3A、3B中引入了分子标记。SVA和口蹄疫病毒（FMDV）同属小RNA科病毒，具有相似的病毒结构，因此可否在SVA的3A、3B区域引入标记，研发分子标记疫苗还需深入研究论证。

Segales等[19]基于VP1基因进行遗传进化分析，将SVA分为3个亚群，第1亚群是原始毒株SVV-001，第2亚群包括1988—1997年美国分离株，第3亚群包括2001年至今的分离株，而SVA/CH/ZZ/2016属第3亚群。该病呈全球性流行，但2015年前报道较少，2015—2017年分离的流行毒株较多。SVA/CH/ZZ/2016株于2016年分离。流行病学调查显示，2016年国内对SVA分离株的报道较多，其遗传进化关系较远，还出现了地方流行株，国外也有相同报道。遗传进化显示，我国南方地区以首次分离毒株SVA-CH-01-2015为代表株，北方毒株以SVA/CH/ZZ/2016流行为主。2017—2020年SVA报道较少，推测该病周期性暴发，并且持续时间较长。

我国主要的生猪养殖区和国外重要的生猪出口国家均在2015—2017年流行期间相继报道SVA疫情，但是不同地域之间的分离株进化关系较远，且国内外各地区也相继报道出地方流行毒株。因此推测该毒株出现变异，呈现地方流行趋势。SVA/CH/ZZ/2016株分离于我国中原地区，而该地区是我国养猪业重要的集散地区，近年来出现多种遗传进化关系毒株，存在相互传染的风险。因此，加强动物检疫工作和做好流行病学调查是预防SVA感染的重中之重。本研究通过分子生物学及生物信息学手段，对分离株SVA/CH/ZZ/2016全基因组测序及分析，阐明了分离毒株的遗传进化关系及各蛋白氨基酸同源性，为进一步研究SVA致病机制、分子流行病学、疫苗及诊断试剂研发奠定了理论基础。

参考文献：

[4]赵晓亚,伍绮文,马静云,等.国内首株猪塞内加谷病毒(SenecaValleyvirus)的分离鉴定[J].中国预防兽医学报,2016,38(11):839-843.

[10]张志,张丽丽,李晓成,等.健康猪体内塞尼卡病毒的分离和鉴定[J].中国预防兽医学报,2019,41(4):418-421.

[17]樊晓旭,赵永刚,王志亮,等.塞尼卡谷病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2016,38(12):959-962.

韩宇,王秀明,张斌,乌吉斯古楞,巨敏莹,刘建奇,宋庆庆,关平原.塞内卡病毒CH/ZZ/2016株全基因组测序与分析[J].中国动物检疫,2020,37(12):108-113.