近年来糖尿病患者数量迅猛增长,糖尿病已成为严重威胁人类健康的全球性疾病[1]。血管钙化是糖尿病血管并发症的主要特征,也是糖尿病患者发生急性心血管事件的重要推手[2,3],因此研究糖尿病血管钙化的潜在调节机制,并发掘出有效干预靶标具有重要意义。血管钙化是由多种因素参与的复杂病理过程,在糖尿病体内高糖、高脂等微环境的刺激下,炎症、氧化应激、晚期糖基化终末产物等均可促进钙化的持续进展[4],其中血管平滑肌细胞由收缩表型向成骨表型转分化被认为是血管钙化形成的共同基础[5]。活化T细胞核因子c1是NFAT转录因子家族的重要成员之一,其可易位至胞核,并与相应靶基因的启动子结合,进而发挥转录调控作用[6]。现有研究表明,NFATc1可能是冠心病风险的重要预测因子[7],其参与调控肺动脉高压、动脉粥样硬化斑块形成等多种病理过程[8,9],通过入核后的转录调控方式影响血管平滑肌细胞表型转分化[10],并能够借助外泌体转运的形式进入血管平滑肌细胞,促进炎症信号介导的血管钙化[11]。然而,在糖尿病状况下,NFATc1与血管钙化的具体关系如何,目前的研究尚不能给出明确的答复。因此本研究利用糖尿病足截肢患者临床样本以及原代小鼠主动脉平滑肌细胞钙化模型,拟探明NFATc1在糖尿病血管钙化中的作用,希望为血管钙化防治提供新的思路。

1、资料和方法

1.1病例选择和分组

纳入2019年8月—2020年3月在本院因糖尿病足行下肢大截肢术的患者共15例,所有纳入患者均签署知情同意书。纳入标准:①患者年龄40～70岁;②所有患者均按照WHO(1999年)糖尿病诊断标准,确诊为2型糖尿病;③所有患者均伴有糖尿病足,且具有截肢指征。排除以下任一项符合的患者:①胃溃疡、胃切除术;②长期服用激素;③免疫抑制治疗;④严重肝肾功能不全者;⑤严重创伤;⑥恶性肿瘤病史。根据患者下肢胫前动脉钙含量水平,以钙含量中位数(6.1mmol/g)将患者分为低钙化组(8例)和高钙化组(7例)。

1.2主要试剂和仪器

C57BL/6小鼠购自江苏大学实验动物中心;DMEM培养液、胎牛血清从维森特公司订购;钙含量检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;NFATc1酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)试剂盒购于振誉生物科技公司;BCA蛋白定量试剂盒购于诺唯赞公司;vonKossa钙盐染色试剂盒为索莱宝公司产品;抗α平滑肌肌动蛋白(alphasmoothmuscleactin,α-SMA)抗体、抗Runt相关转录因子2(runtrelatedtranscriptionfactor2,RUNX2)抗体、抗NFATc1抗体购于Abcam公司;抗β-actin抗体从Proteintech公司订购;所有二抗均购自Abways公司;蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自碧云天公司;NFATc1小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)购于吉玛基因公司。

1.3血清NFATc1检测

收集患者空腹状态下静脉血,室温静置30min后,3000r/min离心15min分离血清。分装后保存于-80℃冰箱,以备后续检测。利用ELISA试剂盒检测血清NFATc1水平,所有操作步骤均按试剂盒说明书进行。

1.4细胞培养及血管钙化模型构建

小鼠颈椎脱位法处死后,分离胸主动脉,剥离外膜,剔除内膜,利用组织贴块法培养MASMC,并用anti-α-SMA抗体进行鉴定,培养3代后的细胞用于后续实验。将5.5mmol/L葡萄糖培养的细胞设为对照组。用22mmol/L葡萄糖模拟糖尿病高糖(highglucose,HG)环境,同时补充成骨诱导液(osteogenesismedia,OM)(2.5mmol/Lβ-甘油磷酸酯+50mg/L抗坏血酸)以构建糖尿病血管钙化体外模型。用24.5mmol/L甘露醇模拟高渗(hypertonicity,HT)环境。故而分为对照组、HG组、OM组、HG+OM组和HT+OM组。为明确NFATc1对MASMCs表型转分化及钙化的影响,利用siControl(siCON)或者可抑制NFATc1表达的siRNA(siRNA1和siRNA2)转染细胞,继而在此基础上构建血管钙化体外模型,分为OM+siCON组、HG+OM+siCON组、HG+OM+siRNA1组和HG+OM+siRNA2组。所有组细胞均在诱导7天后,进行钙化及相关蛋白检测。

1.5钙含量检测

对于组织和细胞样本,用0.6mol/LHCl充分浸泡24h,以离子化钙结晶。收集上清,使用钙含量测定试剂盒检测,所有操作步骤均按试剂盒说明书进行。用BCA蛋白测定试剂盒检测样品中蛋白含量,并以蛋白含量标准化钙化量。

1.6vonKossa钙盐染色

用4%多聚甲醛固定样品后,加入2.5%硝酸银溶液,并于阳光下直射2h,肉眼可见钙结节变为黑色。而后加入5%硫代硫酸钠溶液,室温下反应5min。充分洗涤后,用1%中性红复染3min,继而置于显微镜下观察。

1.7Westernblot检测

按体积分数配置蛋白裂解液(RIPA∶蛋白酶抑制剂∶磷酸酶抑制剂为100∶1∶1),提取组织/细胞蛋白,于沸水中煮8min,加入5×loadingbuffer制备上样缓冲液,以备后续检测使用。提取的蛋白样品,通过SDS-PAGE分离样品,继而转印至聚偏二氟乙烯膜上。经10%脱脂奶粉封闭、孵育一抗及二抗后,用化学发光系统显示图像并分析。

1.8统计学分析

对于正态分布的数据以x±s表示,两组间比较用Studentt检验;3组及以上的比较采用单因素方差分析;探索两者间的相关性采用Pearson相关性分析。对于非正态分布的数据,以中位数及四分位数间距表示,两组间的比较采用非参数检验。使用SPSS22.0软件进行统计分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1血清NFATc1与糖尿病胫前动脉钙化呈正相关

根据胫前动脉钙含量水平,将患者分为低钙化组和高钙化组,高钙化组钙含量是低钙化组的2.8倍(P<0.05;图1A)。此外,两组患者血清NFATc1水平也存在差异,高钙化组患者血清NFATc1水平明显高于低钙化组(P<0.05;图1B)。同时,血清NFATc1与钙含量呈正相关(R2=0.60,P<0.05;图1C)。

2.2糖尿病足截肢胫前动脉中NFATc1表达升高

检测糖尿病足截肢患者胫前动脉组织中NFATc1的表达情况后发现,高钙化组胫前动脉NFATc1表达明显高于低钙化组(P<0.05;图2A和B)。相关性分析发现,胫前动脉中NFATc1含量与钙含量呈正相关(R2=0.48,P<0.05;图2C)。

图1.糖尿病足截肢患者胫前动脉钙含量、血清NFATc1水平及两者相关性

图2.糖尿病足截肢胫前动脉中NFATc1的表达情况及其与钙含量的相关性

2.3高糖促进OM诱导的MASMC成骨样分化并上调NFATc1表达

为进一步明确糖尿病血管钙化与NFATc1的关系,利用HG和OM构建了MASMC模型。Westernblot检测MASMC的表型变化(图3A)发现,单纯HG刺激下,MASMC收缩表型标记物α-SMA和成骨表型标记物RUNX2并无明显变化(图3B和C)。而OM刺激下,α-SMA明显下降,RUNX2明显升高(P<0.05),提示MASMC的成骨表型转分化。与OM组比较,HG+OM进一步抑制了MASMC中α-SMA的表达(P<0.05),且促进了RUNX2的表达(P<0.05),与此同时,HG+OM也显著上调了NFATc1的表达(P<0.05;图3D),这提示NFATc1可能参与调控MASMC的成骨表型转分化。

2.4高糖促进OM诱导的MASMC钙盐沉积

MASMC的成骨表型转分化是钙化形成的关键过程,通过vonKossa钙盐染色和钙含量测定发现,单纯HG并不能诱导MASMC的钙盐沉积,而HG+OM可显著加重MASMC的钙化,是单纯OM刺激下的1.69倍(图4)。

图3.MASMC的成骨表型转分化及NFATc1表达情况(n=4)

图4.MASMC的钙化情况分析(n=4)

2.5高糖促进OM诱导的MASMC表型转分化及钙化与高渗无关

与OM组比较,HG+OM组不仅葡萄糖浓度升高,其渗透压也会明显上升,因此HG+OM组的细胞既受到HG刺激,也会受到HT的影响。故以24.5mmol/L甘露醇为HT条件,设置HT+OM组,用以探明高渗透压对MASMC的作用,进一步明确HG促进的OM条件下MASMC表型转分化和钙化到底是受HG还是受HT影响。与单纯OM刺激相比,HT+OM并未引起MASMC中α-SMA、RUNX2和NFATc1的表达变化(图5A-D),且MASMC钙化也无显著改变(图4A和B)。此外,与HT+OM组相比,HG+OM组α-SMA显著下降,而RUNX2和NFATc1的表达及MASMC钙化均显著升高,提示高HG是MASMC成骨样分化和钙化形成的关键因素。

图5.高渗对MASMC成骨表型转分化的影响(n=4)

2.6沉默NFATc1可抑制高糖与OM介导的MASMC成骨样分化

上述已明确NFATc1在糖尿病血管钙化过程中显著升高,故利用siRNA沉默NFATc1以进一步明确二者关系。siRNA1和siRNA2可显著抑制MASMC中NFATc1的表达(图6A),且与HG+OM+siCON相比,HG+OM+siRNA1组和HG+OM+siRNA2组中α-SMA表达显著上升,而RUNX2的表达明显下降(图6B、C和D),提示沉默NFATc1可延缓高糖诱导的MASMC成骨表型转分化。

图6.NFATc1抑制对MASMC表型转分化的影响(n=4)

2.7沉默NFATc1可抑制高糖与OM介导的MASMC钙盐沉积

在用siRNA抑制NFATc1表达后,vonKossa染色可见MASMC钙结节明显减少。在钙含量检测中也发现,HG+OM+siRNA1组和HG+OM+siRNA2组钙含量均显著低于HG+OM+siCON组,进一步证明了NFATc1在调控糖尿病血管钙化中的作用(图7)。

图7.NFATc1抑制对MASMC钙盐沉积的影响(n=4)

3、讨论

钙化普遍存在于糖尿病患者的血管中,是糖尿病血管并发症的重要病理特征[12]。本研究利用糖尿病足截肢患者血清及胫前动脉组织标本,发现NFATc1水平与糖尿病血管钙化程度呈正相关。进而借助MASMC体外钙化模型,进一步发现抑制NFATc1可显著遏制高糖介导的MASMC钙化,证实NFATc1可能是糖尿病血管钙化的关键调控因子。

血管钙化是羟基磷灰石等矿化结晶异位沉积于血管壁或血管斑块内的过程,在这一过程中成骨破骨平衡被打破,细胞响应于钙化刺激信号,进行成骨表型转分化。细胞质膜释放出基质囊泡充当矿化晶核,囊泡经聚集、融合形成初始钙化结节,并沿着纤维组织有序沉积,推动钙化持续进展[13]。同时,钙化促进因子的逐渐增多,而抑制因子的逐渐减少,也为钙化演进提供了有利条件。对于糖尿病血管钙化而言,由于其存在代谢失衡,使得钙化的刺激因素更加复杂,钙化信号传递也可能具有特殊性。课题组既往研究表明糖尿病血管钙化按照其形态可以分为大钙化和微钙化[14],按照其分布可分为中膜钙化和内膜钙化[15]。虽然同是糖尿病血管钙化,但其调控机制却存在明显差异,这直接反映出糖尿病血管钙化的复杂性。国内外大量研究均试图明确糖尿病血管钙化的具体机制,但仍缺乏有效手段能够遏制糖尿病血管钙化的形成,因此本研究着眼于探寻能够有效抑制糖尿病血管钙化形成的靶标,继而利用糖尿病足截肢胫前动脉标本,发现NFATc1与糖尿病血管钙化存在紧密联系,为进一步的机制探索提供可靠依据。

NFATc1是多种生理及病理过程的关键调节因子,有研究发现NFATc1在慢性肾衰竭大鼠血管钙化中起促进作用,其作用机制与血管平滑肌细胞的成骨表型转分化相关[16]。在本研究也发现了NFATc1在调节糖尿病血管钙化方面具有相似的作用,高糖可介导MASMC收缩表型向成骨表型分化并促进钙盐沉积。沉默NFATc1后,MASMC的成骨表型转分化被明显抑制,钙化也显著减少,提示高糖可通过NFATc1促进MASMC的成骨样分化和钙化形成。在课题组前期研究中还发现了其他分子靶标也参与调控糖尿病血管钙化的进程,如Sortilin[17]、Ghrelin[18]等,这些调控因子间是否有一定内在联系和互作关系,还有待进一步的研究。

NFATc1除了参与调控矿化成骨过程外,其在破骨细胞分化及骨吸收方面也具有重要作用。有研究表明,核因子κB受体激活剂配体可通过激活NFATc1,进而促进其下游靶标抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、基质金属肽酶9等的表达,这些都是破骨细胞形成和发挥功能所必需的[19]。因此NFATc1可能是成骨/破骨调控的分子开关,在维持成骨破骨平衡中发挥至关重要的作用。但是NFATc1如何串联成骨与破骨,以及如何实现成骨破骨间的转换,还需要进一步的研究加以探索。

综上所述,本研究明确了NFATc1与糖尿病血管钙化之间存在紧密联系,糖尿病高糖环境可通过NFATc1促进血管钙化进展,其机制可能与血管平滑肌细胞的成骨表型转分化相关。此次研究为糖尿病血管钙化防治提供了实验支撑和理论依据。

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