糖尿病是一种慢性代谢性疾病，其主要特征是机体血糖水平紊乱，发病率逐年上升，据统计，到2025年，全球将有约3.6亿糖尿病患者[1]。糖尿病患者患心血管疾病的风险高于非糖尿病患者，在我国每年约有300万人死于心血管疾病，严重危害人们的生命健康[2]，缺血性心脏病是心血管疾病中常见病症，临床外科常用的治疗手段是及时恢复缺血区的血流供应即心肌缺血再灌注，但心肌缺血再灌注会使心肌造成更严重的损伤[3]，因此，探究心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的发生机制，对找寻合适的药物预防和治疗缺血性心脏病具有重要意义。自噬在MIRI中发挥重要作用，研究显示通过调控磷酸腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路抑制MIRI的自噬作用，对心肌微血管内皮细胞有保护作用[4]。灯盏花素是从中药中提取出来的，具有抗炎止痛、降糖、活血化瘀等药理作用[5,6,7]，研究表明灯盏花素对糖尿病肾病的治疗具有一定疗效[8]，但其在糖尿病MIRI中的作用尚不清楚。本研究通过制备糖尿病MIRI模型大鼠，给予灯盏花素进行治疗，观察其对糖尿病MIRI模型大鼠的心肌保护作用，为糖尿病MIRI临床治疗药物的开发提供一定的理论依据。

1、材料

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠50只，6～8周龄，体质量为180～210g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SYXK（京）2017-0033。

1.2主要药品、试剂及仪器

灯盏花素购自上海瑞楚生物科技有限公司（质量分数≥98%，货号：R134928）；柠檬酸钠、链脲佐菌素购自德国默克公司；白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒、IL-6ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技公司；兔源单克隆PI3K、Akt、p-PI3K、Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3）、mTOR抗体及兔源多克隆p-Akt抗体购自CST公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自北京博尔西科技有限公司；酶联免疫分析仪购自澳大利亚Techan公司；超低温冰箱购自美国Thermo公司；生物显微镜购自日本尼康公司；凝胶成像系统购自美国伯乐公司。OneTouchUltraVue血糖仪及试纸购自美国强生公司；全自动生化分析仪7180、HIVISION900彩色超声波诊断仪均购自日本日立公司。

2、方法

2.1大鼠模型制备、分组和给药

参考文献方法[9]制备糖尿病大鼠模型，将50只SD雄性大鼠随机分为对照组10只，喂养普通饲料；高脂高糖组40只，喂养高脂高糖饲料。喂养30d后，高脂高糖组小鼠ip链脲佐菌素30mg/(kg·d)，对照组小鼠ip等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，连续注射5d后，经尾静脉采血，测大鼠空腹血糖（FBG),FBG≥16.7mmol/L则糖尿病大鼠模型制备成功。参考文献方法[10]制备MIRI大鼠模型，将40只糖尿病模型大鼠随机分为假手术组、模型组和灯盏花素低、高剂量（100、200mg/kg）组，每组各10只，用3%戊巴比妥钠进行麻醉，插管通过麻醉监测仪观察大鼠血压、心律稳定后，打开胸腔，除假手术组外各组大鼠在冠动脉左前降支下结扎，当结扎部位以下心肌颜色变暗且心电图ST段升高，则表明心肌缺血成功，结扎30min后剪开结扎线，使血流恢复再灌注2h，心脏颜色变红，抬高的ST段降低1/2以上则再灌注成功。糖尿病MIRI大鼠模型构建成功后，灯盏花素低、高剂量组小鼠分别ip100、200mg/kg灯盏花素溶液（溶剂为生理盐水）；对照组、假手术组、模型组小鼠均ip等体积生理盐水，连续给药14d。

2.2标本采集

末次给药后，尾静脉采血，测大鼠FBG后，采集尾静脉血5mL,1800r/min（离心半径10cm）离心10min取血清，储存于-20℃冰箱保存。处死各组大鼠，取其心肌组织，剪取约0.5g用于提取组织蛋白，储存在-80℃冰箱中备用，剩余心肌组织，用4%多聚甲醛溶液固定，做常规石蜡切片，备用。

2.3各组大鼠血脂水平检测

取血清，用全自动血生化仪检测各组大鼠血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。

2.4各组大鼠心脏功能检测

末次给药后，ip10%水合氯醛（3mL/kg）麻醉大鼠，采用多普勒彩色超声检测仪，选取二维模式测定左心长轴切面，检测心率（HR）、左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、平均动脉压（MAP）和左室射血分数（LVEF），连续3个完整心动周期，取平均值。

2.5各组大鼠血清中炎性因子水平检测

取血清，用ELISA试剂盒分别检测IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具体操作步骤参考其说明书。

2.6各组大鼠心肌组织病理变化观察

将“2.2”项中心肌组织切片烘烤后、脱蜡至水化，苏木素染色、伊红染液复染，脱水，透明，封片，镜下观察心肌组织病理形态学变化。

2.7各组大鼠心肌组织LC3、Beclin1、mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平检测

提取心肌组织蛋白，BCA法检测蛋白质量浓度，调整上样蛋白至50μg，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，转膜，加一抗（LC3、Beclin1、mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin,1∶1000),4℃孵育过夜，次日，加二抗（1∶5000）室温孵育2h，洗膜，加ECL发光液，用Bio-Rad成像系统检测蛋白灰度信号，以β-actin为内参照，ImageJ软件定量分析蛋白表达情况。

2.8统计学处理

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计量资料以表示，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠血糖、血脂水平的影响

与对照组相比，假手术组、模型组大鼠FBG及血清TC、TG、LDL-C水平显著升高（P<0.05),HDL-C水平显著降低（P<0.05）；与模型组相比，灯盏花素低、高剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平依次降低（P<0.05),HDL-C水平依次升高（P<0.05）。见表1。

表1灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠血糖、血脂水平的影响

3.2灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠血清炎性因子的影响

与对照组相比，假手术组、模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高（P<0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高（P<0.05）；与模型组相比，灯盏花素低、高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低（P<0.05）。见表2。

表2灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠血清炎性因子水平的影响

3.3灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠心脏功能的影响

与对照组比较，假手术组、模型组大鼠HR、LVEDP显著升高（P<0.05),LVSP、MAP、LVEF显著降低（P<0.05）；与假手术组比较，模型组大鼠HR、LVEDP显著升高（P<0.05),LVSP、MAP、LVEF显著降低（P<0.05）；与模型组相比，灯盏花素低、高剂量组大鼠HR、LVEDP依次降低（P<0.05),LVSP、MAP、LVEF依次升高（P<0.05）。见表3。

3.4灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠心肌组织病理变化的影响

对照组大鼠心肌细胞形态结构完整，细胞排列紧密，纤维结构排列规则；与对照组相比，假手术组细胞排列不规则，纤维结构排列较紊乱；与假手术组相比，模型组大鼠心肌细胞破碎、坏死，细胞排列不规则，心肌纤维断裂，伴有炎性细胞浸润；与模型组相比，灯盏花素低、高剂量组大鼠破碎、坏死的心肌细胞减少，细胞形态逐渐恢复正常，见图1。

表3灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠心脏功能的影响

图1各组大鼠心肌组织病理形态学HE染色结果

3.5灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠心肌组织自噬相关因子LC3-I、LC3-II、Beclin1蛋白表达的影响

与对照组相比，假手术组、模型组大鼠心肌组织LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表达显著升高（P<0.05）；与假手术组相比，模型组大鼠心肌组织LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表达显著升高（P<0.05）；与模型组相比，灯盏花素低、高剂量组大鼠心肌组织LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表达依次降低（P<0.05）。见图2和表4。

图2各组大鼠心肌组织LC3-I、LC3-II、Beclin1蛋白表达

表4灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠心肌组织LC3-I、LC3-II、Beclin1蛋白表达的影响

3.6灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠心肌组织mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响

与对照组相比，假手术组、模型组大鼠心肌组织mTOR、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低（P<0.05）；与假手术组相比，模型组大鼠mTOR、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达显著降低（P<0.05）；与模型组相比，灯盏花素低、高剂量组大鼠心肌组织mTOR、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达依次升高（P<0.05）。见图3和表5。

4、讨论

心肌缺血再灌注是治疗缺血性心脏病最佳治疗策略，同时会导致心脏损害[11]。糖尿病是缺血性心脏病的独立危险因素，会加重MIRI，是患者死亡的主要原因[12]，但其具体机制尚不完全清楚。寻找能够有效减轻糖尿病MIRI，且有较好临床应用前景的药物是目前人们研究的重点之一。本研究发现，模型组较对照组大鼠心肌细胞破碎、坏死，细胞排列紊乱，伴有炎性细胞浸润，血清TC、TG、LDL-C水平、心脏HR、LVEDP显著升高，血清HDL-C水平、LVSP、MAP、LVEF显著降低，与张卫强等[13]研究结果一致，提示大鼠心脏功能降低，血脂水平紊乱，糖尿病MIRI模型大鼠构建成功。灯盏花属于菊科植物，灯盏花素是其主要活性成分，在冠心病、心绞痛等心血管疾病中发挥重要作用[14,15]。支英杰等[16]研究发现，灯盏花素可以改善不稳定型心绞痛患者血脂水平。Wang等[17]研究显示，灯盏花素可以改善慢性完全阻塞患者血运重建后存活心肌的恢复，减少不良心脏事件的发生。本研究发现，与模型组相比，灯盏花素低、高剂量组大鼠心肌组织病变症状减轻，血清TC、TG、LDL-C水平依次降低，HDL-C水平依次升高，大鼠破碎、坏死的心肌细胞减少，细胞形态逐渐恢复正常，心脏HR、LVEDP依次降低，LVSP、MAP、LVEF依次升高，提示灯盏花素对机体血脂水平有调节作用，增强心脏功能，对糖尿病MIRI模型大鼠心肌组织有保护作用。

图3各组大鼠心肌组织mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达

表5灯盏花素对糖尿病MIRI大鼠心肌组织mTOR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响

心肌缺血再灌注会引起广泛的微血管功能障碍，从而加剧器官损害。MIRI与先天免疫系统、炎症有关，糖尿病会引起机体内血小板过度活跃，加重MIRI，增加器官损害和死亡风险[18]。本研究发现，模型组较对照组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高，与雷艺等[19]研究结果一致，提示糖尿病MIRI的发生伴随炎症反应。周莹等[20]研究显示，灯盏花素可以抑制炎性反应，减轻感染性休克患者的心肌损伤程度。本研究发现，与模型组相比，灯盏花素低、高剂量组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平依次降低，提示灯盏花素可以降低炎性因子分泌，减轻糖尿病MIRI大鼠体内炎症反应。

线粒体功能障碍是导致糖尿病患者缺血性心脏病预后不良的重要原因，线粒体自噬是调节线粒体内稳态并及时消除受损线粒体的关键过程[21]。LC3是自噬的标记物，mTOR和Beclin1是2个重要的自噬相关分子在MIRI中起重要作用[22]。本研究发现，模型组较对照组大鼠心肌组织LC3-II/LC3-I、Beclin1显著蛋白表达升高、mTOR蛋白表达显著降低，提示糖尿病MIRI的发生引起机体自噬机制紊乱。Shi等[23]研究发现mTOR通过AMPK/mTOR和PI3K/Akt/mTOR途径在MIRI不同阶段发挥作用。Li等[24]研究显示，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路对MIRI中过度自噬有抑制作用。本研究发现，与模型组相比，灯盏花素低、高剂量组大鼠心肌组织LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表达依次降低，mTOR、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达依次升高，提示灯盏花素可以通过促进PI3K、Akt发生磷酸化以激活PI3K/Akt/mTOR通路，调节自噬相关蛋白表达，进而抑制自噬水平。

综上所述，灯盏花素可以通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路，减少心肌损伤和细胞自噬、降低炎症因子表达，改善糖尿病MIRI大鼠心脏功能。但灯盏花素药理活性较多，其具体的其他作用分子机制仍需进一步探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献：

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杨楠楠,崔智慧,张冰,毕健琨,马青青,汪桂青.灯盏花素通过激活线粒体自噬途径减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤[J].现代药物与临床,2021,36(02):219-225.

基金:河南省科技攻关项目(182102310089)