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Wnt激活剂BML-284与纳布啡共处理对RIH的影响

2025-08-12 40 上传者：管理员

摘要：目的：探讨Wnt激活剂BML-284与纳布啡联合应用对瑞芬太尼诱发的痛觉过敏(RIH)的影响。方法：24只SPF级成年雄性SD大鼠随机分3组(每组8只):对照组(S组)、纳布啡+瑞芬太尼+切口痛模型组(N+R+I组)、瑞芬太尼+切口痛+纳布啡+Wnt激活剂BML-284组(N+R+I+BML-284组)。N+R+I组与N+R+I+BML-284组皆静脉输注瑞芬太尼，剂量为1μg/(kg·min),S组输注等剂量的生理盐水，输注时间为60 min, N+R+I组于瑞芬太尼输注前静脉注射纳布啡(0.6 mg/kg),N+R+I+BML-284组在瑞芬太尼输注前静脉注射纳布啡(0.6 mg/kg)和BML-284(5 mg/kg),输注5 min时N+R+I组和N+R+I+BML-284组建立足底切口术建立切口痛模型。收集脊髓组织，采用ELISA法检测脊髓组织TNF-α和IL-1β的含量，Western Blotting法检测脊髓组织GFAP、Iba1、NR1、NR2A、NR2B及Wnt3a、β-catenin蛋白的表达水平。qRT-PCR检测脊髓组织中Wnt3a和β-catenin的基因表达水平。结果：与N+R+I组比较，N+R+I+BML-284组大鼠T3～T4时的PWL和T2～T4时的PWT均明显降低(P<0.05),脊髓背角组织Wnt3a和β-catenin基因及蛋白水平、TNF-α、IL-1β含量及GFAP、Iba1、NR1和NR2B蛋白水平均明显升高(P<0.05)。结论：纳布啡可以预防RIH的发生，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin通路、NMDA受体活化和炎症因子上调有关。

关键词：
Wnt/β-catenin
切口痛
瑞芬太尼
痛觉过敏
纳布啡
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临床疼痛管理中阿片类药物占有重要地位,对急慢性疼痛和手术引起的疼痛均能有效缓解｡然而,近年来的研究却揭示了一个令人忧虑的现象:阿片类药物,特别是瑞芬太尼可能会导致痛觉过敏,引起疼痛耐受性[1,12]｡由于起效快,半衰期短,输注时间长,没有药物蓄积,瑞芬太尼在临床上获得了广泛的赞誉｡然而,它不仅提供手术过程中的镇痛效果,而且可能导致术后患者对疼痛的感受性明显增强,也就是瑞芬太尼诱发的痛觉过敏(remifentanil-inducedhyperalgesia,RIH)[2]｡这一现象不仅延长了患者的恢复时间,还严重影响了其生活质量｡RIH的发生机制相当复杂,涉及受体功能紊乱､离子通道改变以及神经炎症反应加剧等多重因素｡其后果也十分严重,患者在麻醉恢复期可能变得更加躁动,应激反应加剧,身体的耗氧量随之上升｡这无疑增加了术后镇痛药物的使用量,提高了治疗成本｡更为严重的是,RIH可能导致患者苏醒和恢复质量下降,术后镇痛效果不理想,患者的满意度随之下滑｡这种身心的双重折磨对患者的预后极为不利｡因此,如何有效防治RIH,积极寻找新的策略和方法,以期减少RIH的发生,改善患者的预后,成为当前临床研究的重要课题｡

盐酸纳布啡作为一种兼具κ受体激动与μ受体部分拮抗特性的强效镇痛药物,不仅在临床上展现出卓越的止痛与镇静效果,还显著降低了对呼吸功能的抑制,从而在疼痛管理中占据了一席之地[3]｡根据既往研究[4,5]成果,盐酸纳布啡在预防瑞芬太尼诱发的痛觉过敏(RIH)方面表现出色｡该药物能够有效提升镇静质量,减少麻醉恢复期的躁动现象,并降低不良反应的发生率｡尤其值得一提的是,纳布啡还具有拮抗瑞芬太尼诱导的大鼠痛觉过敏的能力｡进一步的研究揭示,Wnt/β-catenin信号通路在神经系统的发育与功能维持中扮演着核心角色｡这一通路不仅参与神经系统的构建,还影响成年哺乳动物神经系统的稳态[5,6]｡有研究[7]表明,瑞芬太尼通过激活Wnt/β-catenin信号通路,上调β-catenin的表达,进而改变神经系统的敏感性,诱使NMDA受体及其亚基活化｡这一系列过程在RIH的发生与发展中起到了关键的推动作用[6]｡为了深入探究纳布啡在缓解RIH中的具体机制,本研究特别关注了Wnt/β-catenin信号通路的变化｡实验结果显示,纳布啡处理的RIH大鼠脊髓组织中,Wnt3a和β-catenin的基因与蛋白水平显著低于未经纳布啡处理的RIH大鼠｡这一发现提示,纳布啡可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,从而有效抑制RIH的产生[8]｡为了更确凿地证实Wnt/β-catenin通路在纳布啡缓解RIH中的关键作用,本研究进一步实施了挽救实验,利用Wnt通路激活剂进行干预,并通过qRT-PCR和WesternBlotting技术对大鼠脊髓组织中Wnt/β-catenin信号通路相关的基因与蛋白表达进行了详尽的检测｡

1、材料与方法

1.1材料

本研究经哈尔滨医科大学实验动物伦理委员会批准,批准文号:【SYXK(黑)-2019-0001】｡本研究选取了24只成年雄性SPF级SD大鼠作为实验对象,体质量控制在(200±30)g｡实验所需的注射用盐酸瑞芬太尼与盐酸纳布啡注射液均由宜昌人福药业有限责任公司生产｡用于免疫检测的NR2A､NR2B､Wnt3a和β-catenin兔抗大鼠多克隆一抗则全部购自Abcam公司｡

1.2方法

1.2.1动物分组及处理

将实验大鼠随机分为3组:对照组(S组)､纳布啡+瑞芬太尼+切口痛模型组(N+R+I组)和纳布啡+瑞芬太尼+切口痛+Wnt激活剂BML-284组(N+R+I+BML-284组),每组8只大鼠｡在建立模型前,N+R+I组以1.0μg/(kg·min)的速率通过静脉输注瑞芬太尼,而S组则接受相同体积的生理盐水输注｡输注5min后,N+R+I组和N+R+I+BML-284组的大鼠接受切口痛模型建立,S组仅进行七氟醚麻醉､右后足底碘伏消毒及金霉素覆盖处理,不进行切口手术｡N+R+I组在瑞芬太尼输注前3min通过静脉注射给予0.6mg/kg的盐酸纳布啡,其他组则注射相同体积的氯化钠溶液｡

1.2.2痛觉行为学的检测

本研究采用多时间点实验设计,旨在探讨不同时间节点对大鼠痛觉行为的影响｡实验设计包括造模前时间点T0,以及造模后多个时间节点T1~T4,分别对应于造模后2h､6h､24h和48h｡在实验中使用vonFrey电子测痛仪和PL-200热刺痛仪,精确测定大鼠在机械刺激和热刺激下的反应｡同时以记录机械刺激下的缩爪反应阈值(PWT)以及热刺激下的缩爪反应潜伏期(PWL)为主要测量指标｡为确保数据的准确性和可靠性,在每个时间点上进行3次独立测量,并取其平均值进行数据记录｡

1.2.3ELISA检测炎性因子水平

在完成最后一次行为学检测后,采用颈椎脱臼法将大鼠在麻醉状态下进行处死,随后迅速提取其左侧L4~L6脊髓背角组织,并将其储存于-80℃的环境中,以便于后续进行批量检测｡所取出的脊髓组织经过处理制备成匀浆液,按照ELISA试剂盒的操作指南,测定了组织内肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)的含量｡此外,还采用(bicinchoninicaci,BCA)方法测定了组织中的蛋白浓度,进而计算出每克蛋白中这两种因子的具体含量｡WesternBlotting技术是一种广泛应用的实验方法,用于检测蛋白表达水平,以提供更深入的生物学分析｡

1.2.4WesternBlotting检测蛋白表达水平

通过WesternBlotting检测特定蛋白在细胞或组织中的表达情况,从而为研究提供重要数据支持｡选取组织标本并加入蛋白裂解液,制备出匀浆后,在低温条件下离心10min获取上清液,再利用BCA法测定蛋白浓度｡继续SDS-PAGE电泳､转膜和封闭步骤,接种兔抗大鼠一抗(NR1､NR2A､NR2B､Wnt3a､β-catenin和β-actin),并在低温条件下孵育一夜｡随后加入羊抗兔二抗,并在室温条件下孵育1h,进行化学发光显影｡最后利用ImageJ软件计算目标蛋白的相对表达量,通过目标条带与内参条带灰度值的比值(以β-actin为内参)来确定｡

1.3统计学方法

采用SPSS29.0统计学软件进行分析｡基于正态分布的计量资料使用均数±标准差(xs)表示｡独立样本t检验用于比较两组数据,单因素方差分析用于多组比较,重复测量分析用于组内多次测量的比较,P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

为验证Wnt/β-catenin信号通路在纳布啡缓解RIH中的作用,本研究进行了一项挽救实验,并应用Wnt通路激活剂｡在实验中,采用了qRT-PCR和WesternBlotting技术,对大鼠脊髓组织中Wnt/β-catenin通路相关基因和蛋白的表达进行了检测｡结果显示,与N+R+I组相比,N+R+I+BML-284组中Wnt3a和β-catenin的基因及蛋白表达水平显著升高,且差异有统计学意义(P<0.05),见图1~4,表1､表2｡此外,通过ELISA检测,发现N+R+I+BML-284组的TNF-α和IL-1β水平较N+R+I组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),见表3,图5｡

图1两组大鼠脊髓组织Wnt3a和β-catenin基因水平比较

图2两组大鼠脊髓组织Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平比较

表1两组大鼠不同时间点PWL值比较

表2两组大鼠不同时间点PWT值比较

图3两组大鼠不同时间点PWL值比较

图4两组大鼠不同时间点PWT值比较

表3两组大鼠脊髓组织TNF-α和IL-1β水平比较

图5两组大鼠脊髓组织GFAP､Iba1及NMDA受体蛋白表达水平比

3、讨论

纳布啡是一种新型的混合型阿片受体激动-拮抗镇痛药,不仅可用于术前镇痛,也已广泛应于各种疼痛的治疗[5]｡相关研究[14]表明,纳布啡不仅能够有效预防术后RIH,还能够增强镇静效果,减少患者的躁动和不良反应,进而提高疼痛耐受性｡本研究结果表明,与对照组相比,瑞芬太尼诱导的切口疼痛模型大鼠在术后的痛觉阈值(PWL)和痛觉反应时间(PWT)均显著降低,这表明大鼠的痛觉阈值下调,最终导致了RIH现象的出现｡此外,经过纳布啡预处理的大鼠在术后2~48h的痛觉阈值(PWL)和痛觉反应时间(PWT)均明显高于未经过处理的大鼠,表明纳布啡在一定程度上对瑞芬太尼诱导的RIH展现出抑制的作用,这一发现与已有的相关研究结果相一致[5]｡

Wnt/β-catenin信号通路在神经系统的发育及成年哺乳动物神经系统的结构与功能维持中起着关键作用[5]｡当该信号通路被激活时,Wnt配体与受体结合,导致β-catenin在胞质中积累并进入细胞核,与转录因子结合,从而促进靶基因的表达,发挥多种功能｡研究表明,该信号通路在轴突再生､肿瘤生长､精神失常以及神经病理性疼痛等过程中发挥重要作用[9,10]｡神经损伤时,Wnt/β-catenin信号通路被激活并持续表达,而该信号通路的阻断剂可以减轻神经病理性疼痛[6]｡一些研究表明,Wnt/β-catenin信号通路通过调节不同分子参与神经病理性疼痛的发生,例如脊髓脑源性神经营养因子及Nav1.8离子通道的激活[5]｡此外,该信号通路还参与吗啡耐受以及停用吗啡后引起的RIH[11]｡研究显示,瑞芬太尼可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路改变神经系统的易感性,诱导NMDA受体及其亚基的激活,在RIH的发生中发挥重要作用｡一些研究表明,通过抑制Wnt/β-catenin信号通路可以有效预防RIH的发生｡例如,Wnt3a抑制剂可以减轻RIH,而Wnt清除剂能够抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而减少RIH的痛觉超敏｡此外,脊髓Wnt通路通过调节一些分子参与RIH的发病机制｡因此,进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在RIH中的作用机制,对于预防和治疗神经病理性疼痛具有重要意义｡本研究对与Wnt/β-catenin信号通路相关的基因和蛋白表达进行了系统的检测和分析｡实验结果显示,在经过纳布啡预处理的RIH大鼠中,Wnt3和β-catenin的表达水平明显低于未处理的大鼠｡这一发现提示,纳布啡可能通过下调Wnt3和β-catenin的表达,抑制该信号通路的激活,从而对RIH的发生起到一定的抑制作用｡这为进一步探索和理解纳布啡在痛觉调节机制中的潜在作用提供了重要的实验依据｡总的来说,Wnt/β-catenin信号通路在神经病理性疼痛中扮演着重要角色,对神经系统的疼痛传导和炎症反应等过程具有调节作用[13]｡本研究发现:在对RIH大鼠进行纳布啡预处理后,研究观察到脊髓组织中促炎性细胞因子(如TNF-α和IL-1β)的水平显著降低｡同时,NR1和NR2B蛋白的含量也有明显下降｡这表明,纳布啡在缓解RIH方面具有重要的生物学效应｡进一步分析显示,纳布啡可能通过抑制NMDA受体的活化和降低促炎性细胞因子的浓度,从而有效阻止RIH的发生｡此外,研究推测,纳布啡抑制反射性疼痛高敏感性(RIH)的机制可能与其对Wnt/β-catenin信号通路的抑制有关,并且这种作用可能与其降低NMDA受体NR2B亚基的活性及调节炎症反应密切相关｡这些发现为纳布啡在治疗RIH中提供了新的理论基础,表明其潜在应用价值｡由于实验动物样本数量有限,因此还需要更大样本量来进一步探索和理解纳布啡在痛觉调节机制中的潜在作用,为实验提供更重要的理论依据｡

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