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四藤方对MGC-803胃癌细胞生长的影响

2020-10-13 595 上传者：管理员

摘要：目的:研究四藤方对MGC-803胃癌生长的影响,并探讨可能的作用机制。方法:体外培养人胃癌细胞MGC-803,建立人胃癌MGC-803裸小鼠皮下移植瘤模型。随机分组,分为对照组、西药组和中药组,每组10只;对照组生理盐水灌胃,每次0.3mL,每天1次;西药组5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)腹腔注射,每次1mg,每周1次;中药组采用四藤方煎剂灌胃,每次0.3mL,每天1次,含生药1g•mL-1。共治疗8周。治疗期间记录肿瘤生长变化。治疗结束后脱颈椎处死实验动物,剥离肿瘤称量。免疫组织化学法检测Smac/Survivin信号蛋白表达水平。结果:8周治疗后,5-FU和四藤方组裸小鼠皮下移植瘤体积、瘤质量均小于对照组,且移植瘤体积增长也较对照组体积增长缓慢。5-FU和四藤方均能明显上调Caspase-3和Caspase-7蛋白表达,下调Survivin蛋白水平,升高Smac蛋白表达。结论:四藤方可抑制MGC-803胃癌细胞生长,其机制可能与通过调控Smac/Survivin信号转导通路蛋白表达相关。

关键词：
四藤方
氟尿嘧啶
胃癌
胃癌细胞
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中医药作为我国传统的治疗方式,临床上可辅助胃癌治疗,改善患者临床症状,提高生活质量,调节免疫功能,防止复发转移和延长患者生存时间。四藤方由上海市名中医邱佳信教授验方胃肠安中的主要抗肿瘤中药组成,可抑制人胃癌细胞皮下移植瘤生长、增殖。本实验通过建立人胃癌细胞裸小鼠皮下移植瘤模型,观察四藤方对移植瘤生长的影响,并探讨其可能的机制。

1、材料与仪器

1.1细胞株

人胃癌MGC-803细胞,由中国科学院细胞库提供。在含有青霉素、链霉素100U·mL-1及体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中,37℃,体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱中连续培养。

1.2实验动物

BALB/C裸小鼠,4周龄,雄性,30只,体质量19.8～22.5g。由上海中医药大学实验动物中心提供,于SPF级动物实验室内饲养。动物合格证编号:2008001666079。

1.3主要试剂

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)购自上海旭东海普药业,Survivin抗体购自Biogot公司,Smac、Caspase-3、Caspase-7和二抗由美国CST公司提供。

1.4主要仪器设备

化学发光成像系统:上海天能科技有限公司;倒置显微镜:Nikon;二氧化碳培养箱:NuAire;湿盒:上海迈新生物科技公司。

2、实验方法

2.1药物制备

四藤方由红藤30g,野葡萄藤30g,菝葜30g,藤梨根30g组成。将四藤方诸药等比例放入煎药壶内,以8倍量水浸泡生药材30min。武火煮沸,改文火继续煎煮30min,过滤。药渣中加入原比例6倍量水,煎煮30min,过滤。将两次滤液混合,浓缩至含生药1g·mL-1,分装,4℃冰箱备用。调整5-FU药物浓度为1g·L-1,分装,两药均存放于4℃冰箱备用。

2.2动物模型建造、给药

MGC-803细胞体外培养,收集细胞悬液,1200r·min-1离心5min,离心半径8cm。调整浓度为1×107mL-1。于裸小鼠右前肢背部近腋窝处皮下注射,每只0.2mL。观察局部出现明显皮丘后旋转出针,无菌棉球按压止血。接种后标准化饲养,每天观察裸小鼠生存状况和皮下移植瘤生长情况。当皮下移植瘤生长至可测量范围时,随机分组,分为对照组、西药组、中药组,每组10只。分组当日给药。对照组以生理盐水灌胃,每次0.3mL,每天1次;西药组腹腔注射5-FU,每次1mg,每周1次;中药组采用四藤方煎剂灌胃,每次0.3mL,每天1次。共治疗8周。

2.3移植瘤体积、质量测量及取材

开始给药后,每周测量裸小鼠皮下肿瘤的最大长径a和与之垂直的最短横径b。根据肿瘤体积=1/2×瘤体最长长径×最宽宽径2(V=ab2/2),计算肿瘤体积。治疗结束后,脱颈椎处死裸小鼠,剥离瘤体组织,称量肿瘤质量。

2.4免疫组织化学法检测(immunohistochemistry,IHC)

瘤组织样本保存于体积分数4%多聚甲醛中过夜,脱水,石蜡包埋保存。常规切片脱蜡。高温下修复组织抗原,自然降温后,PBS重复洗涤3次,把切片放进湿盒中,加入体积分数3%过氧化氢,室温下加入动物免疫血清,避光孵育。冲洗,平铺于湿盒中,滴加对应的抗体,4℃冰箱中过夜。孵育完成后,PBS冲洗,加入二抗,室温下孵育30min。PBS清洗,放回湿盒中,加入DAB显色液,光镜下观察显色,蒸馏水洗涤。复染,梯度乙醇脱水,封片。光学倒置显微镜下观察每张切片,200倍镜下随机选择4个视野进行拍照保存。镜下细胞核或细胞质中表现黄色、棕黄色或棕褐色颗粒状染色便是蛋白阳性表达。Caspase-7和Caspase-3染色主要出现在细胞质;而Smac、Survivin则是在细胞核和(或)细胞质表达。利用Image-proPlus6.0软件分析照片,测算OD和面积值,计算平均光密度值(meanopticaldensity,MOD)。

MOD=OD/面积

2.5统计学方法

采用SPSS21.0进行统计分析。本研究为连续计量资料,需进行多样本均数比较。若服从正态分布,则以方差分析(One-wayANOVA)比较组间均数差异,均数±标准差(x¯±s)进行描述,LSD两两比较;若资料不满足方差分析条件,以秩和检验(Kruskal-Wallis法)比较组间差异,均数±(下-上四分位数)描述数据。当P≤0.05时,差异具有统计学意义。

3、结果

3.1四藤方对人胃癌MGC-803裸小鼠皮下移植瘤体积的影响

自分组当天直至实验动物取材,平均7天测量裸小鼠皮下移植瘤长径(a)及短径(b),计算肿瘤体积(TV),TV=(ab2)/2。并将横坐标设为治疗时间,纵坐标为肿瘤体积,绘制出3组裸小鼠皮下移植瘤生长曲线图。见图1。

图13组裸小鼠皮下移植瘤生长曲线图

结果表明,各组裸小鼠皮下移植瘤体积增长与治疗时间呈正相关,其中对照组裸小鼠皮下移植瘤生长速度最快,中药组次之,西药组最慢。治疗8周后,各组皮下移植瘤体积均数分别为:中药组:(3942.76±1306.78)mm3,西药组:(3711.43±1115.38)mm3,对照组:(5695.65±1029.00)mm3。西药组抑瘤率34.84%,中药组抑瘤率为30.76%。

3.2四藤方对人胃癌MGC-803裸小鼠皮下移植瘤质量的影响

LSD结果显示,对照组瘤质量与其余两组瘤质量分别比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表13组裸小鼠皮下移植瘤质量比较(x¯±s)

3.3四藤方对裸小鼠皮下移植瘤组织中Smac蛋白表达的影响

IHC检测Smac蛋白表达见图2,蛋白染色阳性表达于细胞质和(或)细胞核。结果显示,四藤方和5-FU可以升高Smac蛋白表达(P<0.05);中药组SmacMOD值与西药组SmacMOD值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

图23组裸小鼠皮下移植瘤组织中Smac蛋白表达(IHC,×100)

3.4四藤方对裸小鼠皮下移植瘤组织中Survivin蛋白水平的影响

Survivin蛋白表达位于细胞质和(或)细胞核。对照组MOD值:0.046±0.007;西药组MOD值:0.015±0.005;中药组MOD值:0.023±0.008。统计结果:中药组、西药组与对照组对比Sur的MOD值,差异有统计学意义(P<0.01)。而中药组与西药组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图33组裸小鼠皮下移植瘤组织中Survivin蛋白表达(IHC,×100)

3.5四藤方对裸小鼠皮下移植瘤组织中Caspase-3蛋白水平的影响

Caspase-3蛋白表达主要位于细胞质。3组移植瘤样本组织Caspase-3的MOD值分别是:对照组:0.023±0.006;西药组:0.042±0.007;中药组:0.039±0.007。统计分析显示,3组裸小鼠皮下移植瘤组织Caspase-3的MOD值比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。而中药组与西药组MOD值相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图43组裸小鼠皮下移植瘤组织中Caspase-3蛋白表达(IHC,×100)

3.6四藤方对裸小鼠皮下移植瘤组织中Caspase-7蛋白表达的影响

Caspase-7蛋白表达出现在细胞质,染为棕黄色或者棕色。3组裸小鼠皮下移植瘤组织Caspase-7的MOD值分别是:对照组:0.026±0.002;西药组:0.043±0.006;中药组:0.039±0.006。统计分析比较,3组MOD值比较,差异具有明显的统计学意义(P<0.01)。而中药组与西药组MOD值相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

图53组裸小鼠皮下移植瘤组织中Caspase-7蛋白表达(IHC,×100)

4、讨论

胃癌临床表现繁多,证属本虚标实。脾胃受损,失其和胃降逆之功,中焦气化不利,痰气交阻为主要病因病机。四藤方由上海市名老中医邱佳信教授临床验方“胃肠安”拆方而来。胃肠安方可显著延长胃癌进展期患者生存时间,降低术后转移率和复发率[1,2]。实验证明胃肠安方可抑制胃癌血管生成[3]和胃癌细胞凋亡[4],抑制胃癌细胞STAT3磷酸化[5]。胃肠安中清热解毒中药藤梨根、红藤、野葡萄藤、菝葜(即为四藤方)为其中主要抗肿瘤中药。前期研究表明四藤方可以抑制SGC-7901人胃癌裸小鼠皮下移植瘤生长[6]。本实验结果显示,四藤方对人胃癌MGC-803裸小鼠皮下移植瘤生长具有一定的抑制作用。

Caspase是一组高度特异性半胱氨酸蛋白酶,存在于细胞质溶胶中,其中Caspase-3和Caspase-7为细胞凋亡的执行者,可作用于底物,裂解PARP,激活相关特异性核酸酶使细胞凋亡。Survivin又名存活素、生存素,能够促进细胞增殖,调控细胞周期,影响血管生成,在已知IAP家族中抗凋亡作用最强[7]。可通过内源、外源通路作用于终末效应蛋白Caspase-3和Caspase-7[8]。本研究结果显示,四藤方可以升高Caspase-3、Caspase-7,降低Survivin。Smac/DIABLO(Secondmitochondrialactivatorofcaspases/directIAPbindingproteinwithlowPI),与细胞凋亡调控密切相关。主要与IAP家族BIR结构域发生特异性结合,消除IAP对Caspase的抑制,激活酶联反应[9,10,11]。Smac可以活化pro-caspase-3,并增强Caspase酶活性[12]。本研究结果显示,四藤方可以升高Smac表达,提示调控Smac表达是四藤方作用的重要机制。

综上所述,四藤方可抑制人胃癌MGC-803裸小鼠皮下移植瘤增长,其作用机制可能与上调Smac、Caspase-3和Caspase-7表达水平,抑制Survivin蛋白表达有关。

参考文献：

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[3]卢艳琳,沈克平.邱佳信教授运用健脾法治疗胃肠道恶性肿瘤思路浅析[J].上海中医药大学学报,2015,29(1):1-4.

[4]赵爱光,杨金坤,尤圣富,等.中药胃肠安诱导裸鼠胃癌移植瘤细胞凋亡的途径及基因调控的研究[J].中西医结合学报,2007,5(3):287-297.

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[6]何萍,沈克平,胡兵,等.四藤方对人胃癌裸鼠皮下移植瘤生长及凋亡作用[J].中华中医药杂志,2013,28(12):3632-3635.

王菁雯,何萍,胡兵,沈克平.四藤方对MGC-803胃癌细胞生长的影响及机制研究[J].中医学报,2020,35(10):2207-2211.