摘要:目的初步探究肿瘤外泌体miR-21对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法通过ExoQuick提取并分离得到胃癌细胞SGC-7091外泌体,采用电子显微镜观察外泌体直径大小,Westernblot法检测外泌体标志性白细胞分化抗原群63(CD63)和肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)。外泌体与胃癌SGC-7091细胞共培养24h后实时荧光定量PCR检测miR-21表达,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,Westernblot法检测增殖蛋白细胞周期蛋白D1(cyclinD1)以及凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)和caspase-3蛋白表达。结果成功提取分离40~100nmSGC-7091细胞源性外泌体颗粒,其表达TSG101和CD63蛋白。外泌体与SGC-7091细胞共培养促进miR-21表达(P<0.01),降低TUNEL染色阳性细胞数目(P<0.01),促进细胞增殖(P<0.01),下调caspase-3表达(P<0.01),上调Bcl-2和cyclinD1表达(均P<0.01)。结论肿瘤细胞来源外泌体可以通过递送miR-21促进胃癌细胞增殖,抑制细胞凋亡进而加快胃癌转移。
胃癌是一种常见的恶性肿瘤病变。近5年胃癌发病率呈上升趋势[1]。胃癌位居全国肿瘤发病的第二位,仅次于肺癌。胃癌的主要治疗手段包括手术、化疗以及放疗,由于在我国胃癌早期检出率较低,多数患者就诊时已处于中晚期,传统手段治疗下胃癌5年生存率始终偏低[2,3]。深入研究胃癌的发生和发展机制对改善胃癌患者的生存质量具有重大意义。
外泌体是一种直径约40~100nm的膜性囊泡网[4]。外泌体可介导多种信号传导,例如细胞与细胞间的信息传递等[5,6]。外泌体特异性蛋白分子主要包括白细胞分化抗原群63(CD63)、CD9和肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)等。因此,在实验研究中通过特异性检测相关标志物有助于外泌体的提取与分离[7]。研究发现,外泌体的宿主来源具有不同的分子调控作用,其中肿瘤细胞来源外泌体可通过调控细胞间信号传导,促进血管新生等细胞生物学行为,影响肿瘤细胞代谢状态和侵袭增殖能力等,是目前肿瘤学研究的重点和热点之一[8]。但是目前有关肿瘤外泌体对肿瘤细胞的调节机制尚不完全清楚。本研究拟探讨肿瘤源性外泌体miR-21对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,为进一步探索胃癌发生和发展过程的分子作用机制提供理论支持。
1、材料与方法
1.1 实验细胞与主要试剂
人胃癌细胞株SGC-7091来自美国ATCC细胞库。胎牛血清和细胞培养液购于美国Gibco公司。荧光定量实时PCR(real-timePCR,RT-PCR)试剂盒购自日本Takara公司。PCR引物由广州锐博公司合成。外泌体提取试剂盒购自美国SystemBiosciences公司。B淋巴细胞瘤-2(B-celllymphoma-2,Bcl-2)和caspase-3单克隆抗体购自美国CellSignalingTechnology公司。兔抗人细胞周期素D1(cyclinD1)购自美国SantaCruz公司。兔抗人TSG101和CD63购自英国Abcam公司。兔抗人β-actin单克隆抗体购自武汉Proteintech公司。TUNEL染色试剂盒购自上海碧云天公司。
1.2 实验主要仪器和设备
PCR仪器购自武汉赛默飞ABI公司。TWK-FST32型细胞组织匀浆仪购自武汉泰普拓公司。Micro17R型高速冷冻离心机和FC型全自动多功能酶标检测仪购自武汉赛默飞世尔科技(中国)有限公司。GPJ9-TS100-F型倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司。1658033型电泳仪和ChemiDocXRS+成像系统购自美国Bio-Rad公司。
1.3 细胞培养与外泌体共培养处理
将实验细胞分为两组,分别为对照组和外泌体组。37℃5%CO2及饱和湿度条件下培养,细胞贴壁生长,之后每2天换液1次。待细胞长满瓶底后进行细胞传代处理(0.25%的胰蛋白酶消化2min)。其中外泌体组采用与细胞培养液混合方式加入终浓度为0.50μg/μL的外泌体处理细胞24h,对照组细胞常规细胞培养液培养24h。
1.4 肿瘤细胞外泌体提取
采用处理完成的无外泌体的血清完全培养液培养48h,收集细胞上清液并进行离心处理。按照试剂盒进行外泌体提取。首先将培养完成的细胞上清液转移至无菌培养皿,并与等体积ExoQuickexosomeprecipitationsolution(SBI,美国)充分混合,将混合完成4℃条件下静置20h,混悬液以3000r/min离心20min,弃去细胞上清后1500r/min离心10min,收集得到外泌体沉淀物。
1.5 外泌体检测
1.5.1 电子显微镜观察外泌体
2%戊二醛重悬并固定外泌体,PBS清洗2次,1%的饿酸固定时长1h,PBS清洗2次,乙醇脱水,将乙醇与环氧丙烷等比例混匀,室温条件下浸泡10min,后转移至环氧丙烷中再浸泡10min,最后将所取标本浸透、干燥、包埋、聚合、切片和染色,电子显微镜下观察外泌体形态学特征。
1.5.2 Westernblot检测
外泌体样品定量,对外泌体标志性蛋白CD63和TSG101进行定量检测。对细胞上清液进行高速离心30000r/min,离心30min,得到细胞上清液沉淀;加入细胞裂解液于冰上裂解10min;BCA法测定蛋白质浓度;定量上样,电泳,转膜,孵育对应抗体;显影定量检测上清液沉淀物CD63和TSG101表达情况。
1.6 TUNEL染色
倾去细胞培养液,按照TUNEL染色试剂盒说明书进行相关检测。
1.7 MTT检测细胞增殖
将消化后的SGC-7091细胞按照1×104/孔接种于96孔板,细胞贴壁生长24h后,加入终浓度为0.50μg/μL的外泌体处理细胞24h,每个浓度设置6个复孔,每孔加入MTT溶液10μL继续培养1h,酶标仪设定波长为570nm检测各孔的吸光度(absorbance,A)值。
1.8 RT-PCR检测miR-21表达
使用紫外分光光度计检测RNA样品浓度及260nm与280nm处的A值比值,之后进行RNA样品浓度标化;按照RNA反转录试剂盒说明书,配置mRNA反转录混合体系。U6上游引物:5'-CCTCACTGTCCACCTTCCA-3';下游引物:5'-GGGTGTAAAACGCAGCTCA-3'。miR-21上游引物:5'-GGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3';下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。将qPCR反应参数设置为:92℃,30s;92℃,5s;60℃,31s,共进行30个循环。采用7300SystemSDSSoftware分析数据,根据2-△△Ct值相对定量样本中miR-21表达。
1.9 Westernblot实验
将处理完成的SGC-7091放置于1.5mL的组织研磨管内并按照1∶4比例加入细胞裂解液放置在已经预冷后的细胞组织匀浆仪中进行研磨;4℃12000r/min离心10min,收集细胞上清液,并进行蛋白质浓度定量检测;每孔上样量为40μg进行蛋白质凝胶电泳实验,根据目的蛋白相对分子质量大小以及蛋白marker指示进行切胶,湿转转膜法将蛋白转移至PVDF膜上,脱脂牛奶封闭2h,孵育对应Bcl-2(1∶1000)、caspase-3(1∶1000)、cyclinD1(1∶500)和β-actin(1∶5000)置于4℃条件下过夜,孵育各自对应二抗(1∶5000)1~2h,于摇床摇晃洗膜,TPBS洗涤后加入ECL,使用胶片曝光,图片扫描后用ImageJ软件计算各条带的灰度值,以各目标条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。
1.10 统计学分析
采用SPSS20.0软件进行数据分析。数据采用均数±标准差表示,多组之间比较采用ANOVA分析方法,两组间差异比较采用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2、结果
2.1 肿瘤细胞外泌体提取与鉴定
透射电子显微镜观察胃癌细胞株SGC-7091源性外泌体呈椭圆形或部分圆形形状,粒径大小为40~100nm。与对照组比较,外泌体组高表达CD63和TSG101,表明成功提取到SGC-7091外泌体(图1)。
2.2 肿瘤外泌体对SGC-7091细胞miR-21表达的影响
与对照组比较,外泌体组SGC-7091细胞miR-21表达增加(P<0.01,图2)。
2.3 肿瘤外泌体对SGC-7091细胞凋亡的影响
TUNEL染色检测胃癌细胞株SGC-7091凋亡情况显示,与对照组比较,外泌体组细胞凋亡降低(P<0.01,图3)。
2.4 肿瘤外泌体对SGC-7091细胞增殖的影响
MTT染色检测SGC-7091细胞增殖情况显示,与对照组比较,外泌体组细胞增殖活性升高(P<0.01,图4)。
2.5 肿瘤外泌体对SGC-7091细胞增殖和凋亡蛋白的影响
Westernblot检测增殖蛋白cyclinD1以及凋亡蛋白caspase-3和Bcl-2的表达显示,与对照组比较,外泌体组cyclinD1和Bcl-2表达增加(均P<0.01),caspase-3表达降低(P<0.01,图5)。
3、讨论
胃癌是全球肿瘤患者死亡的第二大因素。幽门螺杆菌、慢性胃炎、环境因素以及遗传因素等是造成胃癌的主要原因[9]。近年来研究发现,胃癌患者血液中外泌体相对健康人高出近1倍,其中不同肿瘤组织和细胞来源外泌体中所包含的生物活性物质如mRNA、蛋白质和miRNA等可以递送至特异性细胞,进而抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[10]。其中外泌体源性miRNA具有较好的稳定性,可能成为一种新的肿瘤标志物[11]。因此,外泌体源性miRNA有望成为胃癌早期诊断的检测靶标,为胃癌患者开拓新的治疗策略。
miRNA是一类内源性的小分子RNA,不具有蛋白质编码功能。miRNA可以通过靶向目标蛋白,抑制其翻译,从而降低靶基因的表达水平,进而参与相关基因表达。既往研究发现,miR-21是与胃癌发生和发展密切相关的miRNA。进一步体外培养胃癌细胞株,通过抑制miR-21可以促进细胞凋亡,抑制细胞增殖[12]。胃癌细胞株MGC-803细胞中,miR-21表达上调。姜黄素可以通过miR-21/PTEN/Akt信号通路抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡[13]。miR-21在胃癌的发生和发展中发挥重要作用。外泌体具有体积小和分布均匀等特点,适合作为纳米级别药物载体,在胃癌的治疗中发挥重要的作用。转染miR-21抑制剂可以抑制巨噬细胞外泌体对胃癌细胞BGC-823的作用,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移[14,15]。但是目前有关肿瘤自身外泌体源性miR-21与肿瘤的增殖和凋亡的关系尚不完全明确。本实验前期通过提取胃癌细胞株SGC-9071外泌体,探究其内含物质miR-21对自身细胞功能的影响。结果发现,外泌体直径大小为40~100nm,高表达TSG101和CD63,是一种双层膜状囊泡。在成功提取肿瘤细胞外泌体并将其与胃癌SGC-9071细胞共培养后,本研究组通过RT-PCR检测发现,与对照组比较,外泌体组细胞miR-21表达上升,提示肿瘤外泌体可能通过递送miR-21影响细胞相关生物学功能。为了进一步明确外泌体miR-21对胃癌细胞的影响,本研究通过TUNEL染色发现,外泌体与肿瘤细胞共培养可以降低细胞凋亡率,同时Westernblot检测也发现,caspase-3表达降低,Bcl-2和cyclinD1表达上升,提示外泌体miR-21可能通过作用细胞凋亡和增殖影响胃癌的发生和发展。
综上所述,本研究通过探究肿瘤外泌体源性miR-21与肿瘤细胞凋亡和增殖的关系发现,肿瘤细胞外泌体源性miR-21可能通过抑制细胞凋亡和促进细胞增殖加快胃癌的进程。
参考文献:
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文章来源:李长江,洪琛.肿瘤源性外泌体miR-21对胃癌细胞增殖和凋亡的影响[J].实用肿瘤杂志,2022,37(02):123-127.
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目前胃癌逐渐成为了威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一,据国际癌症研究机构IARC的调查结果显示,胃癌的发病率居世界第五位,在中国农村地区,胃癌更是成为了较为常见的恶性肿瘤之一,且多发于老年男性群体中,属于我国癌症防治的重点类型[1,2]。胃癌的发生率与死亡率较高,胃癌的预后效果较差,多数患者在得到明确诊断时,病情已达到中晚期阶段,此时病灶已出现局部转移,或是出现全身性转移,对其预后造成了极大的威胁。
2024-03-29胃癌是常见的癌症之一[1]。研究表明,miRNA具有干预肿瘤发生发展的功能,可作为监测癌症的生物标志物[2,3]。研究证实,miRNA能够调控下游靶基因,从而在胃癌中发挥致癌或抑癌作用[4]。miR-181a是STAT3介导的TCRαβ+CD8+T淋巴细胞白血病生存网络中的新参与者[5]。miR-181a可作为治疗靶点和肿瘤标志物。靶向致癌miR-181a-2-3p可抑制胃癌的生长并降低顺铂耐药性[6]。
2024-03-27胃癌是原发于胃部的恶性肿瘤,胃部黏膜因为遗传、饮食、外界因素等不断被破坏、修复,进而逐渐形成癌变。胃癌患者早期症状不明显,当疾病进展至晚期时,肿瘤导致机体胃黏膜溃疡,引起出血等症状[1]。在胃癌的发展进程中,易发生淋巴道、血道的转移,也可能发生腹膜的种植性转移。早期胃癌可以采取手术治疗,晚期胃癌通常已经丧失手术机会,只能通过化疗控制病情[2]。
2024-03-21胃癌(gastric carcinoma, GC)多发于50岁以上人群,且死亡率居高不下,该病的发生与病菌感染、工作压力及生活压力增加、饮食结构发生变化、免疫细胞浸润、遗传等因素密切相关,且近年来GC呈现年轻化倾向[1,2]。早期GC患者的5年生存率可达90%以上,但多数GC患者早期无特异性症状,仅出现腹部不适、上腹部疼痛等症状,易与胃炎、胃淋巴瘤等疾病相混淆,导致病情延误,加大临床治疗难度,不利于改善预后[3]。
2024-03-15胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤,起病隐匿,确诊时多为进展期,治疗难度较大,根治术是临床现阶段治疗胃癌的重要手段,可延长患者生存期[1]。但临床实践中发现一部分患者术后会并发吻合口瘘,严重影响患者病情转归,也是导致患者围手术期病死的主要原因之一[2]。因此,积极探寻有效的生物学指标实现胃癌根治术后吻合口瘘的早期诊断与预测,对确保手术疗效、预防术后吻合口瘘的发生具有重要意义。
2024-03-15胃癌是消化系统常见恶性肿瘤,其早期临床症状隐匿,患者就诊时多为进展期胃癌,临床预后通常不佳[1]。淋巴结转移是胃癌常见转移途径,与患者治疗方案制定及临床预后有关[2]。壁外血管侵犯(extramural vessel invasion,EMVI)是胃癌常见的转移方式,它是指肿瘤细胞侵入固有肌层外的静脉血管[3]。
2024-03-15血清肿瘤标志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)[1]是一种广谱肿瘤标志物,已被证实与癌细胞增殖密切相关。胃癌的发生、发展、转移是由于多种因素共同发挥作用的一个复杂过程。故本研究对85例胃癌患者腹膜转移的情况进行调查,并分析血清NLR、CEA、AFP、CA125对腹膜转移的评估价值,以期为胃癌患者预测腹膜转移提供参考。
2024-03-15胃癌约占所有新发恶性肿瘤的9%,仅低于肺癌、乳腺癌、肠癌[1]。手术是胃癌治疗的主要手段,能够有效延长患者生存时间,但术后并发症、转移复发风险较高,特别是身体功能下降的老年患者[2]。相关研究显示,TNM分期是评估胃癌患者预后的重要因素,但敏感度和特异度不够理想[3]。
2024-03-12胃癌(gastric cancer, GC)是全球高发病率和高死亡率的消化系统恶性肿瘤之一[1]。在我国,胃癌发病人数和死亡人数均排在第三位[2],其中死亡人数约占全球的50%。胃癌早期缺乏典型的症状和体征,确诊困难,大多数患者确诊时已进展为晚期[3]。近年来,胃癌的诊断技术及治疗手段取得了一定的进展,然而胃癌患者的预后状况并没有得到显著改善。因此,进一步研究胃癌的发病机制,发现新的治疗靶点和新型生物标志物对于胃癌的治疗显得尤为迫切。
2024-03-08胃癌、结直肠癌的发生率和病死率均位居全球恶性肿瘤的前五名。癌因性疲乏是一种从诊断到生命终结的持续的、与癌症或癌症治疗有关但与活动无关的疲惫或者疲乏,无法通过休息或者睡眠缓解。我国胃癌、结直肠癌患者癌因性疲乏发生率分别高达91.6%、92.1%,癌因性疲乏是癌症住院患者经历的最大痛苦的重要预测因素之一。
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