细粒棘球蚴病是一种古老的慢性寄生虫病，公元前400年就有人类对此病的记载[1]。因细粒棘球蚴在人类宿主体内生长缓慢，早期感染的患者无自觉不适症状，临床发病往往因为包囊破裂引起的过敏反应、继发感染或中毒症状。除了从临床症状和体征很难早期发现细粒棘球蚴病以外，还因为感染早期病灶微小、无特异性，临床采用B超、X射线片、CT、磁共振等辅助检查手段很难辨别，而且产生费用较高，患者难以承受，这使得细粒棘球蚴病的防控成为难点，同时也严重威胁全球范围内生活在牧区人们的生命安全。至今为止，仍无有效的方法来预防该疾病的发生，甚至做到临床早期诊断都很难。

彭心宇[2,3]在临床外科手术解剖中发现肝细粒棘球蚴外囊与肝组织间存在可分离间隙，沿此间隙可完整摘除肝细粒棘球蚴病灶外囊。通过病理学镜下观察发现细粒棘球蚴外囊壁为一层排列整齐致密的纤维组织，通过Masson染色发现成纤维细胞为其主要组成部分。以往研究表明，胚胎时期的间充质干细胞可分化为成纤维细胞[4]，作者推测细粒棘球蚴外囊壁的形成和宿主间充质干细胞有关联。课题组既往研究发现从细粒棘球蚴外囊壁中分离出来的细胞，可以贴壁生长，形态同间充质干细胞一样，也可以诱导成脂分化及钙化[4,5,6,7]，这似乎更能进一步说明宿主间充质干细胞在细粒棘球蚴外层纤维囊形成过程中发挥了至关重要的作用。近些年有研究表明细粒棘球蚴通过其寄生宿主后形成的外层纤维囊诱导的精氨酸酶途径来逃脱宿主保护性免疫反应[8]。由此推测，细粒棘球蚴逃脱宿主免疫杀伤过程可能是通过某种途径调动宿主体内间充质干细胞来形成保护性外囊。课题组的研究已经证实细粒棘球蚴可以促进骨髓间充质干细胞纤维化及钙化[9,10]，这更进一步说明细粒棘球蚴可以对间充质干细胞产生影响，进而使细粒棘球蚴保护性纤维外囊的形成有了可能。

细粒棘球蚴纤维外囊形成的病理生理过程涉及到细胞的增殖及分化。目前，国内外有关细粒棘球蚴与间充质干细胞之间相互作用影响的报道很少，细粒棘球蚴与干细胞增殖方面的研究目前还是空白。已有研究报道Notch信号通路在干细胞增殖和血管生成中起着重要作用[11]。Notch信号通路是通过多种受体以及配体共同产生的作用，目前已明确的受体有Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4，明确的配体有Jagged-1和Jagged-2。另外还有Hes和Hey家族作为下游的靶基因。研究显示，在骨髓间充质干细胞的增殖过程中Notch信号通路相关蛋白Notch1-Jagged1等表达也伴随增多，这一现象表明了Notch信号通路具有可以调控骨髓间充质干细胞增殖的作用[12]。该实验通过CCK-8法检测细粒棘球蚴对骨髓间充质干细胞增殖的影响，又通过Westernblot、实时荧光定量PCR方法检测Notch通路上游、下游相关蛋白及mRNA的表达变化来判断这种影响是否与Notch通路有关，有望为细粒棘球蚴外囊形成机制奠定理论基础，进而为细粒棘球蚴感染中间宿主后获得免疫逃逸机制提供一定的理论依据，甚至可能为预防和早期诊断提供新的研究思路。

1、材料和方法

1.1 设计

细胞学实验，多样本均数比较采用非参数Kruskal-WallisH检验，两组均数比较采用非参数卡方检验。

1.2 时间及地点

实验于2019年6月至2020年1月在石河子大学医学院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

实验所用动物为C57BL/6小鼠，由新疆医科大学动物实验中心提供，共80只，雌雄各40只，通过调节室内温度、湿度和光周期进行饲养。挑选母鼠繁殖下的健康小鼠作为实验用鼠，三四周龄，雌雄不限，体质量15-20g。该动物实验获得石河子大学医学院第一附属医院伦理审查委员会批准(许可证编号：A2017-008-01)。

1.3.2 实验试剂、仪器

DMEM低糖培养基、TrypLETMExpressEnzyme、胎牛血清、1640培养基(Gibco公司，美国)；MUCMD-90041小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒、MUCMX-90031小鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒(赛业，中国)；CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒(东仁化学科技上海有限公司，中国)；Notch-1引物、Jagged-1引物、Hes-1引物、β-actin引物(上海生工生物工程公司，中国)；Notch-1多克隆抗体、Jagged-1单克隆抗体、Hes-1单克隆抗体(Abcam公司，美国)；Westernblot彩虹蛋白Mark标记(上海生工生物工程公司，中国)；Westernblot化学发光试剂盒、Trizol、β-actin单克隆抗体(Sigma公司，美国)；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根酶标记山羊抗兔IgG(中杉金桥生物技术有限公司，中国)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司，美国)；酶标仪、核酸定量仪(ThermoElectronCorporation，美国)；Westernblot凝胶成像分析仪、Westernblot蛋白电泳/电转系统(Bio-Rad公司，美国)；特异性抑制剂DAPT(Apexbio公司，美国)。

1.4 方法

1.4.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离和体外培养及诱导鉴定

使用全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞。取C57BL/6小鼠双侧股骨，暴露骨髓腔，用配置好的DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集冲洗液接种于培养皿，放入培养箱静置培养，4h后首次换液，以后每隔两三天换液，原代培养5d可达90%融合，按照1∶2比例传代，取第3代细胞进行实验，按小鼠骨髓间充质干细胞成脂及成骨诱导分化试剂盒说明书进行成脂及成骨分化能力鉴定。

1.4.2 细粒棘球蚴原头蚴的提取及活性检测

(1)细粒棘球绦虫原头蚴提取：从昌吉屠宰场获取感染细粒棘球蚴病羊的肝脏，清洗消毒后选取单囊型细粒棘球蚴病灶，用注射器抽取细粒棘球蚴囊内容物，目测囊液清澈则符合实验条件。将囊液注入容器内等待原头蚴自然沉淀；吸除上层囊液及囊皮，使用PBS洗涤沉淀物10-12次，观察洗涤液清澈，自然沉淀物即为细粒棘球绦虫原头蚴。

(2)显微镜观察形态及活性检测：在倒置显微镜下观察细粒棘球蚴原头蚴的形态和蠕动活性。将10μL原头蚴培养液(细粒棘球绦虫原头蚴培养于含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液中)与10μL0.5%伊红染液混合于载玻片上，等待5min，显微镜记录总原头蚴、死亡原头蚴(红染)的数量，计算原头蚴的活性。计算公式为：(总原头蚴量-死亡原头蚴量)/总原头蚴量×100%；活性>90%方可用于下一步实验。

1.4.3 细粒棘球蚴对骨髓间充质干细胞增殖和Notch通路上游、下游相关蛋白及mRNA表达的影响

(1)实验分组：分为单独骨髓间充质干细胞组、特异性抑制剂DAPT组、细粒棘球蚴原头蚴组、细粒棘球蚴原头蚴+特异性抑制剂DAPT组。第3代骨髓间充质干细胞接种于6孔板，每孔1×106个，每孔加入细粒棘球蚴原头蚴或DAPT，细粒棘球蚴原头蚴数量为500个/孔，DAPT浓度为2.5mmol/L；培养基为加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基。

(2)各组骨髓间充质干细胞增殖情况：培养箱条件设定37℃、体积分数为5%CO2浓度，各组骨髓间充质干细胞培养1,2,3d后，使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。

(3)实时荧光定量PCR检测各组骨髓间充质干细胞中Notch信号通路Notch-1,Jagged-1,Hes-1mRNA表达水平：各组骨髓间充质干细胞培养1,2,3d，使用Trizol提取总RNA，然后利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，再使用实时定量荧光PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR分析。以β-actin为内参照，采用2-ΔΔCt法计算Notch-1、Jagged-1和Hes-1mRNA相对表达量。各基因引物序列及产物大小见表1。

(4)Westernblot检测各组骨髓间充质干细胞中Notch信号通路相关Notch1,Jagged1,Hes1蛋白表达水平：各组骨髓间充质干细胞培养1,2,3d，加入400μL含PMSF的裂解液，裂解液按1mL裂解液加10μLPMSF(100mmol/L)配制，于冰上裂解5min后用干净的细胞刷刷取细胞并移至1.5mL离心管，在4℃下12000r/min离心10min，将离心后的上清移出至混有溴酚蓝的离心管中，煮沸10min，保存备用。

每组取等量蛋白样品行SDS-PAGE电泳、转膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2h，分别加入小鼠Notch-1抗体、Jagged-1抗体、Hes-1抗体，4℃冰箱孵育过夜；次日加入山羊抗兔IgG辣根酶标记二抗，室温孵育2h，使用增强化学发光试剂(ECL)显色、胶片曝光，最后以β-actin为内参照，将各目的蛋白条带与内参照蛋白条带的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.5 主要观察指标

各组骨髓间充质干细胞增殖能力以及Notch信号通路相关Notch1,Jagged1,Hes1蛋白和mRNA的表达。

1.6 统计学分析

应用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，多样本均数比较采用非参数KruskalWallisH检验，两组均数比较采用非参数卡方检验，P<0.05为差异有显著性意义。用GraphPadPrism5.0软件进行图形绘制。

2、结果

2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的形态观察及诱导鉴定结果

取C57BL/6小鼠下肢骨，见图1A，原代培养1d后可见有少量细胞贴壁生长，见图1B，杂细胞较多；培养5d细胞达80%融合，传代后继续培养。随着传代次数增加，贴壁细胞逐渐纯化；第3代贴壁细胞以长梭形为主，整体呈成纤维样、放射状，见图1C。

小鼠骨髓间充质干细胞在成骨诱导液中逐渐变成不规则多边形，部分区域细胞聚集生长；28d行茜素红染色后在原细胞密集区可见红色钙结节，见图1D。小鼠骨髓间充质干细胞在成脂细胞诱导液中逐渐变成短梭形；15d行油红O染色后在细胞质中充满红色脂滴，见图1E。

2.2 细粒棘球蚴感染羊肝、原头蚴镜下观察及活性鉴定结果

感染细粒棘球蚴的羊肝，见图2A，在无菌条件下抽取原头蚴，使用倒置显微镜观察细粒棘球蚴原头蚴的形态、活性，见图2B；伊红染色5min后，快速记录活性较好的原头蚴数量(拒染色)和活性较差死亡的原头蚴数量(红染)，计算细粒棘球蚴原头蚴的活性为(93±2)%，见图2C。

2.3 骨髓间充质干细胞与细粒棘球蚴原头蚴共培养实验

骨髓间充质干细胞单独培养，以长梭形为主，见图3A；细粒棘球蚴原头蚴与骨髓间充质干细胞共培养时，原头蚴形态完整，蠕动活跃，无失活变黑，见图3B。

2.4 CCK-8试剂盒测定各组骨髓间充质干细胞培养不同时间点的增殖情况

培养1,2,3d，与单独骨髓间充质干细胞组相比，特异性抑制剂DAPT组细胞增殖受到抑制，细粒棘球蚴原头蚴组细胞增殖明显；与特异性抑制剂DAPT组相比，细粒棘球蚴原头蚴+特异性抑制剂DAPT组细胞增殖上调。上述结果组间比较差异均有显著性意义(P<0.05)，见图4。

2.5 实时荧光定量PCR检测各组骨髓间充质干细胞培养不同时间点的Notch-1,Jagged-1和Hes-1mRNA表达水平

各组于培养1,2,3d检测Notch-1,Jagged-1和Hes-1mRNA相对表达量：单独骨髓间充质干细胞组优于特异性抑制剂DAPT组，细粒棘球蚴原头蚴组优于单独骨髓间充质干细胞组，细粒棘球蚴原头蚴+特异性抑制剂DAPT组优于特异性抑制剂DAPT组。上述结果组间比较差异均有显著性意义(P<0.05)，见图5。

2.6 Westernblot检测各组骨髓间充质干细胞培养不同时间点的Notch-1,Jagged-1和Hes-1蛋白水平

各组于培养1,2,3d检测Notch-1,Jagged-1和Hes-1蛋白相对表达量：单独骨髓间充质干细胞组优于特异性抑制剂DAPT组，细粒棘球蚴原头蚴组优于单独骨髓间充质干细胞组，细粒棘球蚴原头蚴+特异性抑制剂DAPT组优于特异性抑制剂DAPT组。上述结果组间比较差异均有显著性意义(P<0.05)，见表2和图6。

3、讨论

实验结果显示：共培养实验1,2,3d,4组骨髓间充质干细胞的增殖趋势保持一致。(1)细粒棘球蚴原头蚴组优于单独骨髓间充质干细胞组，细胞增殖明显加快，这说明在相同培养条件下，细粒棘球蚴可促进骨髓间充质干细胞的增殖；(2)单独骨髓间充质干细胞组优于特异性抑制剂DAPT组，这表明使用Notch信号通路特异性抑制剂DAPT后，骨髓间充质干细胞增殖受到抑制，进一步说明骨髓间充质干细胞的增殖受到Notch信号通路的调控。这一结果与之前关于Notch信号通路对骨髓间充质干细胞增殖有调控作用的报道是一致的[12];(3)细粒棘球蚴原头蚴+特异性抑制剂DAPT组优于特异性抑制剂DAPT组，这一现象的解释有2种可能：一是细粒棘球蚴通过影响Notch信号通路促进骨髓间充质干细胞的增殖，二是细粒棘球蚴对骨髓间充质干细胞的促增殖作用可能通过其他信号传统途径，这一促增殖过程与Notch信号通路无关。

通过检测不同时间点各组Notch信号通路上游Notch-1、Jagged-1和下游Hes-1的mRNA和蛋白的表达量发现：(1)细粒棘球蚴原头蚴组高于单独骨髓间充质干细胞组，这表明原头蚴可促进骨髓间充质干细胞的增殖，并且这种促增殖效应可通过Notch信号通路完成；(2)单独骨髓间充质干细胞组高于特异性抑制剂DAPT组，这表明Notch信号通路特异性抑制剂DAPT可以抑制骨髓间充质干细胞的增殖，骨髓间充质干细胞可通过Notch信号通路完成增殖；(3)细粒棘球蚴原头蚴+特异性抑制剂DAPT组高于特异性抑制剂DAPT组，可得出细粒棘球蚴对骨髓间充质干细胞的促增殖作用是通过Notch信号通路实现的。

该实验通过应用DAPT阻断了Notch信号通路，发现骨髓间充质干细胞的增殖活性明显降低，这与刘玉林等[13]报道相一致，并且该实验发现Notch信号通路相关蛋白的表达也随之降低，这说明细粒棘球蚴原头蚴可以通过上调Notch信号通路来促进骨髓间充质干细胞增殖。课题组已有实验报道细粒棘球蚴可促进骨髓间充质干细胞的纤维化及钙化[9,10]。这样看来，细粒棘球蚴原头蚴对骨髓间充质干细胞的促增殖、纤维化及钙化的作用能力，似乎构成了细粒棘球蚴纤维外囊形成假说的基础，但还远远不够完善。目前全世界对细粒棘球蚴免疫逃逸机制研究概括为2个方面：一是Th1和Th2偏移理论，二是免疫细胞能量代谢理论。Th1和Th2偏移理论主要基于寄生虫感染宿主后，Th1反应有助于宿主杀灭寄生虫，Th2反应有助于虫体逃脱宿主免疫杀伤。NEWPORT等[14]通过检测细粒棘球蚴病患者血清中的细胞因子证明了Th2细胞的细胞因子占主导地位。MOURGLIA-ETTLIN等[15]通过检测早期感染细粒棘球蚴中间宿主Th1和Th2相关细胞因子的表达，发现感染早期Th1细胞因子的表达高于Th2，随着时间的进展，感染7d后，则出现了Th2细胞因子的表达高于Th1的现象。在这一偏移理论中，细粒棘球蚴感染宿主后形成的纤维外囊发挥了关键作用[16]。

细粒棘球蚴纤维外囊形成假说的提出基于间充质干细胞的诸多优点。它不但具有很强的增殖能力以及向多种细胞分化的潜能，并且没有伦理学限制、获取来源广泛、体外易培养等，更为重要的是间充质干细胞具有迁移、修复机体损伤组织的能力[11,17,18]。现在体育职业运动员的肌腱损伤修复在骨科康复领域一直是个难题，因为肌腱的血供差、易瘢痕修复，结果是很难保证职业运动生涯的继续。一项研究表明，骨髓间充质干细胞可以从组织学和生物力学方面改善早期肌腱的愈合[19]。目前，已经在动物模型和人类临床试验中发现，骨髓间充质干细胞有望用于修复各种退行性疾病受损的组织[20,21,22,23,24]。

骨髓间充质干细胞能够修复机体损伤组织的前提是其具有归巢能力和迁移能力，而影响归巢和迁移能力的因素有两类：化学和机械因素。化学因素包括趋化因子、细胞因子和生长因子，例如骨桥蛋白通过与整联蛋白β1的连接，增加了骨髓间充质干细胞中整联蛋白β1的表达并促进了骨髓间充质干细胞的迁移[25]；血管内皮生长因子A直接可以促进骨髓间充质干细胞迁移和增殖[26]；碱性成纤维细胞生长因子增强了移植的骨髓间充质干细胞植入和分化能力，恢复了心脏功能[27]。机械因素包括机械应变、剪应力、基质刚度和微重力，例如在通过外周血液循环迁移到损伤组织部位的过程中，骨髓间充质干细胞黏附在血管壁上，并以循环机械应变和血液剪应力的形式受到施加在血管壁上的血流动力。在一项体外研究中，研究人员将骨髓间充质干细胞移植到皮肤组织扩张的活体动物模型中，跟踪骨髓间充质干细胞的迁移，确认在机械拉伸存在的情况下，迁移的骨髓间充质干细胞对皮肤再生的贡献[28]。目前，基质刚度对骨髓间充质干细胞迁移的影响已成为众多研究的焦点。有实验表明，人骨髓间充质干细胞通过功能性肌动蛋白细胞骨架迁移到基质较坚硬部分，组装的微管网络是骨髓间充质干细胞定向迁移所必需的[29]。

间充质干细胞拥有了归巢和迁徙能力，使得它有可能到达机体损伤组织部位。目前，间充质干细胞修复受损组织的机制公认有2种：一是间充质干细胞的旁分泌作用，二是间充质干细胞的增殖、定向分化。许多研究显示，将间充质干细胞移植到实验对象体内，可以通过分泌旁分泌因子来促使受损部位的封闭，这有利于受损组织的愈合。例如，通过大鼠心肌梗死模型研究发现，大鼠骨髓间充质干细胞分泌旁分泌因子(转化生长因子β、成纤维细胞生长因子2、血管生成素2、血管内皮生长因子1)触发血管生成和迁移作用，从而促进心肌愈合并改善心脏功能[30]。在骨髓间充质干细胞处理的小鼠烧伤模型中，通过免疫印迹分析发现，与新血管形成相关的基因转化生长因子β1、血管内皮生长因子表达增加[20]。在小鼠急性肾损伤模型中，小鼠骨髓间充质干细胞通过产生促有丝分裂和促存活因子胰岛素样生长因子1对肾小管细胞修复发挥有益作用[31]。WAKABAYASHI等[32]在大鼠大脑中动脉闭塞缺血模型研究中发现，静脉移植的骨髓间充质干细胞可以提高神经营养因子的表达从而使得脑梗死面积较少。过表达基质细胞衍生因子1的大鼠骨髓间充质干细胞可提高皮肤成纤维细胞和角质形成细胞的活性，促进了上皮再形成和血管生成，从而促进了大鼠皮肤伤口的愈合[23]。

间充质干细胞归巢、迁移及修复损伤组织的能力，使得细粒棘球蚴在感染宿主后可以募集到间充质干细胞。而细粒棘球蚴促进骨髓间充质干细胞增殖、分化的能力，最终使得细粒棘球蚴形成保护性纤维外囊成为了可能。当然细粒棘球蚴通过什么途径来调控Notch信号通路，从而实现了促进骨髓间充质干细胞增殖、分化，还有待进一步研究。目前已有研究表明由免疫细胞产生的多效应因子白细胞介素22在炎症依赖性环境中可调节骨髓间充质干细胞的增殖、迁移和分化作用[33]。该实验中细粒棘球蚴对骨髓间充质干细胞的增殖作用是否通过白细胞介素22来实现，还有待进一步研究。此外，该研究是体外细胞实验，目前还缺少动物体内造模实验的相关数据，它不能完全反映中间宿主感染细粒棘球蚴后的具体生理环境，课题组将继续进行更深入的研究，以期望了解细粒棘球蚴外层纤维包囊形成机制与感染宿主后获得免疫逃逸之间的相互关系，在预防和感染早期诊断开拓一个新的研究方向。

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文章来源：梁学奇,周慧,武杰,习羽,何家赓,秦乐,陈雪玲,吴向未,孙凡,牛建华.细粒棘球蚴促进骨髓间充质干细胞的增殖[J].中国组织工程研究,2022,26(19):3148-3154.