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芍药甘草汤对哮喘大鼠Treg细胞的作用探讨

2020-11-21 301 上传者：管理员

摘要：目的:研究PI3K/Akt信号通路介导芍药甘草汤对支气管哮喘大鼠调节性T细胞(Treg)的干预作用，探讨芍药甘草汤防治支气管哮喘的作用机制。方法:雄性SD大鼠40只，随机分成5组，每组8只，即正常对照组、模型组、地塞米松组、芍药甘草汤组和中西医结合组。除正常对照组大鼠外其余各组均使用腹腔注射卵白蛋白(OVA)致敏并雾化诱发建立大鼠哮喘模型。正常对照组和模型组大鼠以生理盐水灌胃给药，其余各组给予相应药物灌胃给药。实验结束后使用免疫组化方法检测大鼠肺组织P-AKT、PI3K表达，使用流式细胞学技术检测大鼠脾脏单个核细胞液中Treg细胞水平。结果:与正常对照组比较，模型组大鼠P-AKT、PI3K阳性染色面积及累积光密度均显著升高，而Treg细胞含量显著减少(P<0.01);与模型组比较，芍药甘草汤组、地塞米松组和中西医结合组均可显著减少P-AKT和PI3K阳性染色面积(P<0.05或0.01);地塞米松组、芍药甘草汤组和中西医结合组均显著增加Treg细胞含量(P<0.05或0.01)，同时中西医结合组和地塞米松组大鼠P-AKT、PI3K累积光密度值均明显降低(P<0.05)。结论:芍药甘草汤治疗支气管哮喘的作用机制可能通过调控PI3K/Akt信号通路，从而调节哮喘大鼠Treg细胞的作用有关。

关键词：
信号通路
呼吸内科
哮喘
芍药甘草汤
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支气管哮喘是一种临床常见病、多发病，其特征为慢性气道炎症性疾病，目前我国哮喘患者大约3000万，全球哮喘患者至少有3亿。哮喘全球策略标准化治疗方案对哮喘的管理和治疗具有指导意义，但临床效果不尽相同，我国哮喘的未控制率仍高达39.2%[1]。Meta分析显示传统中医药在支气管哮喘防治方面具有一定优势[2]。芍药甘草汤为出自《伤寒论》著名经方，具有调和肝脾、缓急止痛的功效，目前已广泛应用于临床，如肌肉痉挛性疾病[3]。笔者前期研究发现芍药甘草汤能调节Treg细胞及其细胞因子的失衡[4]，但具体干预机制未明。本项目主要观察PI3K/Akt(磷脂酰肌醇激酶/丝-苏氨酸激酶)信号通路介导芍药甘草汤对哮喘大鼠Treg细胞的作用，以探讨芍药甘草汤防治支气管哮喘的作用机制。

1、材料

1.1实验动物

雄性SD大鼠40只，体质量(180±20)g，由上海斯莱克动物实验有限公司提供，动物生产许可证号:SCKX(沪)2017-0015。所有动物均饲养于浙江中医药大学动物实验中心清洁级动物房，饲养许可证号SYXK(浙)2013-0184。实验动物的处置严格按照浙江中医药大学动物实验中心的伦理相关规定进行。

1.2实验药物及试剂

芍药甘草汤由浙江省中西医结合医院制剂室制成流浸膏(芍药和甘草的比例1∶1)，生药含量1g·mL-1;醋酸地塞米松片:浙江仙琚制药股份有限公司，批号:161257。卵白蛋白:Sigma公司，货号:SLBB5992V;氢氧化铝:Thermo公司，货号:77161;CD25-ApC抗体:Ebioscience公司，货号:17-0390-82;FOXP3-PE抗体:Ebioscience公司，货号:12-5773;P-AKT抗体:Affinity公司，货号:AF0908;PI3K抗体:Affinity公司，货号:AF6242。1.3实验仪器PowerWaveX340BIO-TEK酶标仪:ThermoScientific公司;FACSCalibur流式细胞仪:Becton-Dickinson公司;JJ-12J脱水机:武汉俊杰电子有限公司;JB-P5包埋机:武汉俊杰电子有限公司;RM2016病理切片机:上海徕卡仪器有限公司;ECLIPSETI-SR倒置荧光显微镜:日本尼康;DS-U3成像系统:日本尼康。

2、方法

2.1分组、造模和给药

40只大鼠，随机分为5组，即正常对照组、模型组、地塞米松组、芍药甘草汤组和中西医结合组，每组8只。使用腹腔注射卵白蛋白(OVA)致敏并雾化诱发建立大鼠哮喘模型[5]。除正常对照组外，其余各组大鼠在第1天、第8天分别腹腔注射造模溶液1mL(含氢氧化铝100mg、卵白蛋白100mg)致敏。从第15天开始，除正常对照组外，其余各组大鼠分组装入塑料容器(30L)，使用1%卵白蛋白激发液超声雾化激发，每组激发时间30min/d，正常对照组大鼠用生理盐水代替卵白蛋白雾化刺激，时间为30min/d，连续4周。各实验组大鼠均从造模第15天起雾化激发后半小时对大鼠灌胃给药至末次激发。按人体与动物体型系数的折算公式，确定各药物剂量。地塞米松组给予地塞米松溶液1mg·kg-1灌胃给药;芍药甘草汤组给予芍药甘草流浸膏5g·kg-1灌胃给药;中西医结合组给予地塞米松溶液0.5mg·kg-1和芍药甘草流浸膏5g·kg-1灌胃给药;正常对照组和模型组用生理盐水灌胃给药。

2.2标本采集和处理

各组大鼠末次激发24h后取其外周血置于抗凝管中，处死大鼠后打开胸腔无菌取出右上肺，使用10%甲醛固定，观察大鼠肺组织病理形态学变化。摘取大鼠脾脏，放入EP管(微型离心管)中，置于-20℃冰箱冷冻保存。

2.3观察指标及测定

2.3.1大鼠肺组织病理形态学观察

将各组大鼠右上肺组织置于10%甲醛溶液中固定、脱水、包埋、切片、HE染色、封片，光镜下观察大鼠肺病理形态学变化。

2.3.2免疫组化方法检测大鼠肺组织P-AKT、PI3K表达

切片经3%H2O2孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗，5min×3次。滴加封闭液(5%BSA)，在湿盒中室温放置30min。去除封闭液后滴加适宜浓度的P-AKT、PI3K一抗(均1:200)置湿盒中4℃孵育过夜，再用PBS5min×3次洗去一抗，去除标本外的PBS。滴加生物素化二抗工作液，室温置湿盒中孵育20min，用PBS5min×3次洗去二抗，去除标本外的PBS。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温置湿盒中孵育20min，用PBS5min×3次洗去，用滤纸擦去标本外的PBS。DAB显色剂显色，自来水充分冲洗。再进行苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。使用图像分析系统，测定阳性染色面积及累积光密度值。

2.3.3流式细胞术检测大鼠脾脏Treg细胞含量

将各组大鼠脾脏取出后，放入装有冷PBS的培养皿中，剪切脾脏成3mm×3mm×1mm小块组织，用载玻片轻轻研磨脾脏小块;然后使用300目筛网过滤获得脾脏单细胞悬液，用冷PBS洗涤后加入红细胞裂解液室温避光孵育15min，随后使用1500r·min-1转速离心5min;最后将细胞重悬于RPMI1640中，用台酚蓝染色计数活细胞数，并使用RPMI1640调节细胞浓度为2×106/mL。各管中分别加入20μLCD4-FITC、20μLCD25-ApC，放入4℃冰箱中避光孵育15min;随后加入20μLFoxp3抗体，4℃孵育50min，避光;PermBuffer(200μL)清洗两次，接着用400μLHanks缓冲液重悬。在各管中取200μL上机终体积重悬细胞注入标记好的流式管中，上流式检测各组大鼠外周血中Treg数量的变化。每个样品均设同型对照，24h内采用BD流式细胞仪检测分析。

2.4统计学方法

应用IBM公司SPSS25.0统计软件，正态分布的计量资料数据以表示;多样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法检验;P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1各组大鼠肺组织病理形态学变化

正常对照组大鼠气道黏膜光滑，无水肿，管腔无闭塞，未见黏液栓，肺组织周围无明显炎症细胞聚集。模型组大鼠气道黏膜水肿明显，管腔狭小，部分可见黏液栓，肺小血管管壁增厚，肺组织周围可见较多炎症细胞聚集。其余各组大鼠气道管腔有不同程度变小，肺组织周围存在不同程度的炎症细胞聚集，炎症程度较模型组减轻。见图1。

图1各组大鼠肺组织病理形态学观察(HE，×200)

3.2各组大鼠肺组织P-AKT、PI3K表达的免疫组化测定结果

与正常对照组比较，模型组大鼠P-AKT、PI3K阳性染色且阳性染色面积和累积光密度值均显著升高(P<0.01);与模型组比较，地塞米松组、芍药甘草汤组和中西医结合组大鼠P-AKT、PI3K阳性染色面积均明显降低(P<0.01或0.05);与模型组比较，地塞米松组和中西医结合组大鼠P-AKT、PI3K累积光密度值均明显降低(P<0.05)。见图2～图3，表1。

图2各组大鼠肺组织p-Akt表达免疫组化测定结果(×400)

图3各组大鼠肺组织PI3K表达的免疫组化测定结果(×400)

3.3各组大鼠脾脏Treg细胞含量比较

与正常对照组比较，模型组大鼠脾脏Treg细胞含量显著降低(P<0.01)。与模型组相比较，地塞米松组、芍药甘草汤组和中西医结合组组均显著增加Treg细胞含量(P<0.05或0.01),3组之间比较无统计学差异(P>0.05)，见表2。

4、讨论

哮喘的发病机制较为复杂，其中免疫学机制是其发病的重要机制之一。调节性T细胞(Treg)和T辅助细胞17(Th17)来源于共同的初始T细胞，由于细胞因子环境的不同而各自分化，两者具有相互拮抗的生物学功能，一旦Thl7/Treg平衡失调，则会引发病理性免疫反应、造成机体病理状态，导致哮喘发病[6,7]。芍药甘草汤由芍药和甘草二味草药等剂量组成，是中医名家张仲景的经典方剂。前期药理实验研究证实芍药甘草汤具有明显的抗炎解痉、抑制气道重构等作用，对支气管哮喘具有较好防治作用[5,8]。本项目研究表明，与模型组比较，芍药甘草汤组、地塞米松组和中西医结合组均显著增加Treg细胞含量(P<0.05或0.01)，表明芍药甘草汤对支气管哮喘防治作用可能与提高Treg细胞有关，但需要进一步研究其作用机制。

表1各组大鼠肺组织p-Akt、PI3K表达的比较

表2各组大鼠脾脏Treg细胞含量的比较

磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)是一种催化磷酯醇3位羟基磷酸化，产生肌醇酯质产物的特异性激酶。研究表明，PI3K参与哮喘的慢性气道炎症过程，在哮喘淋巴细胞的活化、分化及哮喘相关细胞因子的产生中起到重要作用[9,10]。使用PI3K选择性抑制剂作用于哮喘小鼠，结果与对照组相比，炎症细胞及炎症介质显著减少，同时也显著降低了血清IgE水平[11]。本项目前期研究表明芍药甘草汤能调节Treg/Th17比例从而控制哮喘发作[4,5]，但缺乏进一步的机制研究，如Treg/Th17分化的上游调控机制等，所以非常有必要进一步深入研究芍药甘草汤干预哮喘发病的作用机制。本实验研究表明，模型组大鼠P-AKT、PI3K阳性染色面积及累积光密度均显著升高;与模型组比较，地塞米松组、芍药甘草汤组和中西医结合组均可显著降低P-AKT和PI3K阳性染色面积(P<0.05或0.01);同时地塞米松组及中西医结合组大鼠P-AKT、PI3K累积光密度值均明显降低(P<0.05)。需要指出的是中西医结合组采用的是一半剂量地塞米松，与地塞米松组比较，P-AKT和PI3K阳性染色面积和累积光密度值差异无统计学意义，且实验结束后中西医结合组大鼠一般状态较地塞米松组好。提示芍药甘草汤联合地塞米松治疗支气管哮喘能减少地塞米松剂量，减少激素相关副作用。同时在今后课题设计上可增加中药各浓度组，地塞米松单独减量组，进一步完善实验研究方案，减少实验误差。

参考文献：

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汝触会,何飞,郑琦,季也民,徐俭朴,蔡宛如.基于PI3K/Akt信号通路探讨芍药甘草汤对哮喘大鼠Treg细胞的作用[J].中国中医药科技,2020(06):862-865.