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胎便中支链脂肪酸与新生儿肠道菌群的相关性研究

2025-05-21 61 上传者：管理员

摘要：旨在探究支链脂肪酸(BCFA)对新生儿肠道菌群的影响，采用气相色谱-质谱(GC-MS)对不同胎龄新生儿胎便中BCFA组成和含量进行测定，结合16SrRNA测序技术对新生儿肠道菌群组成进行分析，探究胎便中BCFA与新生儿肠道菌群的相关性。结果表明：新生儿胎便样本中共含有70种脂肪酸，其中BCFA31种，足月儿胎便中的BCFA含量显著高于早产儿的(p<0.05);门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)为新生儿肠道菌群的优势菌群；属水平上，男婴和女婴的优势菌群分别为乳杆菌属(Lactobacillus)和假单胞菌属(Pseudomonas);BCFA含量与新生儿肠道中厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门(Actinobacteriota)、蓝藻细菌(Cyanobacteriota)、螺旋菌门(Spirochaetota)均显著相关，其中与拟杆菌门的相关性最显著(p<0.01)。综上，新生儿胎便中的BCFA含量与新生儿肠道菌群具有一定的相关性。

关键词：
拟杆菌门
支链脂肪酸
早产儿
碳链骨架
肠道菌群
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支链脂肪酸(BCFA)是一类在碳链骨架上含一个或多个以甲基支链为主的功能性饱和脂肪酸，通过甲基在碳骨架上位置的不同，其主要分为甲基位于碳链倒数第二位的异构支链脂肪酸(iso－BCFA)和甲基位于碳链倒数第三位的反异构支链脂肪酸(anteiso－BCFA)［1－2］。目前研究BCFA的主要饮食来源包括反刍动物乳制品、肉制品和人乳脂［3－4］等，另外微生物细胞膜和人体分泌物中也含有BCFA［5－6］。BCFA在人乳脂中的含量高达1．5%［7］，在牛、绵羊和山羊乳脂中的含量分别为总脂肪酸的0．5%～1．0%、2．2%和1．5%［8－9］。

母乳是婴幼儿最安全理想的食物，母乳中的BCFA对于婴幼儿尤其早产儿的肠道健康具有良好的调控作用，而早产儿胎脂中BCFA含量仅约为足月儿的一半［10］。婴儿坏死性小肠结肠炎患者多为胎龄不足34周的早产儿，这表明该疾病的发展可能与BCFA缺乏相关。Ｒan－Ｒessler等［11］研究发现，添加约20%的BCFA可以改善新生幼鼠的肠道菌群定植，降低坏死性结肠炎的发病率。同时，BCFA与哺乳动物胃肠道中菌群存在一定联系，如Xin等［12］研究发现，健康牛犊组粪便中BCFA(iso－C15∶0、iso－C16∶0、iso－C17∶0、iso－C18∶0等)含量显著低于腹泻牛犊组，牛犊粪便中BCFA的种类和含量与牛犊的肠道形态和生理功能完整性密切相关。

目前，对于BCFA的研究主要集中在母乳、肉制品等膳食来源，但基于新生儿肠道健康的相关研究报道非常有限。因此，本文利用气相色谱－质谱(GC－MS)分析新生儿胎便中BCFA的组成和含量，并通过16SrＲNA对新生儿胎便样本进行测序，以此检测不同胎龄新生儿肠道菌群组成，由此分析BCFA与新生儿肠道菌群的相关性，以期为BCFA在调节早产儿肠道功能方面的应用提供理论支持。

1、材料与方法

1．1实验材料

1．1．1样本与试剂

胎便样本，由无锡市妇幼保健院新生儿科提供，取样经相关家属同意，以人为实验的研究均遵守1975年《赫尔辛基宣言》规定的伦理标准。本研究共收集新生儿胎便样本51份，其中早期早产儿(28～32周)6份，中度早产儿(32～34周)9份，近足月儿(34～37周)21份，足月儿(＞37周)15份。用于菌群测序的14份胎便样本来自未经抗生素治疗，且未患心脏病、腹泻及严重消化道畸形的新生儿，包括1份早产儿样本(女)和13份足月儿样本(7男6女)。每份样本均分装4管，其中3管贴上统一标签，待送样测序，另外1管需尽快提取脂质，所有待测样本均储存于－80℃超低温冰箱。37种混合脂肪酸甲酯标准品(C4～C24)，上海西格玛奥德里奇有限公司;13－甲基十四烷酸(iso－C15∶0)、12－甲基十四烷酸(anteiso－C15∶0)、15－甲基十六烷酸(iso－C17∶0)、14－甲基十六烷酸(anteiso－C17∶0)、异硬脂酸(iso－C18∶0)标准品，纯度均在98%以上，C14∶0(质量浓度15g/100mL)、C15∶0(质量浓度22g/100mL)、C16∶0(质量浓度29g/100mL)、12－甲基十三烷酸(iso－C14∶0，质量浓度8g/100mL)、anteiso－C15∶0(质量浓度9g/100mL)、14－甲基十五烷酸(iso－C16∶0，质量浓度8g/100mL)和anteiso－C17∶0(质量浓度9g/100mL)的混标溶液，瑞典马尔默LarodanFineChemicals公司;三氯甲烷、无水甲醇为分析纯，无水硫酸钠、无水碳酸钠为化学纯，上海国药集团化学试剂有限公司;乙酰氯为分析纯，上海麦克林生化科技有限公司;正己烷为色谱级，上海安谱实验科技股份有限公司。

1．1．2仪器与设备

MettlerToledoAB104－N电子天平，梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;ＲE－52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;MixPlus旋涡振荡仪，合肥艾本森仪器有限公司;PegasusBT气相色谱串联飞行时间质谱联用仪，美国力可公司;Centrifuge5810离心机，德国Eppendorf公司;SE812型氮吹仪，上海安谱实验科技股份有限公司。

1．2实验方法

1．2．1胎便脂质的提取

向胎便样本中加入含0．05%2，6－二叔丁基－4－甲基苯酚的三氯甲烷－甲醇(体积比2∶1)溶液，超声40min，经0．2g的硅胶柱(60～120μm)过滤，去除悬浮在溶液表面的上皮细胞，用约5g无水硫酸钠吸水，再用硅胶柱二次过滤，所得滤液使用旋转蒸发法和氮吹法除去溶剂，将提取的胎便脂质储存于－25℃冰箱，备用。

1．2．2脂肪酸组成分析

参考Stránsky等［13］的方法进行脂肪酸甲酯化。将脂质用三氯甲烷－甲醇(体积比2∶3)溶液溶解，加入乙酰氯，于70℃水浴反应60min。再用碳酸钠溶液中和，静置分层后收集有机相，经无水硫酸钠脱水，氮吹，得到脂肪酸甲酯。用正己烷复溶，过有机尼龙滤膜后进行GC－MS分析。GC条件:DB－5型毛细管色谱柱(30m×0．25mm×0．10μm);进样口温度280℃;进样量0．5μL;升温程序为初温150℃，保持1min，以10℃/min升至280℃，保持15min;载气为高纯度氦气(99．999%)，流速1．0mL/min。MS条件:电子电离源;灯丝能量70eV;离子源温度230℃;传输线温度300℃;发射电流1mA;全扫描模式，质量扫描范围(m/z)50～450;溶剂延迟时间160s。以脂肪酸甲酯标准品的出峰时间进行定性，采用峰面积归一化法进行定量。

1．2．3胎便中肠道菌群测序

胎便样本送至上海美吉生物医药科技有限公司进行检测。对样本进行DNA抽提，对V3～V4可变区进行PCＲ扩增，利用IlluminaMiSeq平台进行高通量测序，对不同序列进行分类学分析以获得物种注释结果。对比Silva119数据库，在门和属分类水平下统计每个样本的肠道菌群组成，分析新生儿肠道菌群多样性、结构组成差异等。

1．2．4数据处理

通过SPSS20．0软件对数据进行分析处理，结果以“平均值±标准差”表示。通过单因素方差分析中的Duncan检验法进行多组间差异分析，p＜0．05表示具有统计学意义。运用皮尔逊相关系数分析相关性。

2、结果与讨论

2．1新生儿胎便中脂肪酸的组成和含量

不同胎龄新生儿胎便的脂肪酸组成和含量见表1。

表1不同胎龄新生儿胎便的脂肪酸组成和含量

由表1可知，新生儿胎便样本中共发现70种脂肪酸，其中直链饱和脂肪酸(SSFA)18种，单不饱和脂肪酸(MUFA)14种，多不饱和脂肪酸(PUFA)7种，BCFA31种。脂肪酸碳链长度分布在C12～C29之间，其中偶数碳链脂肪酸较多。

SSFA中，新生儿胎便中棕榈酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)是主要的脂肪酸，其中C16∶0在总脂肪酸中占比最高。早产儿胎便中SSFA含量显著高于足月儿(p＜0．05)，其中中度早产儿和近足月儿胎便中的SSFA含量无显著差异(p＞0．05)，均显著低于早期早产儿胎便中SSFA的含量且又显著高于足月儿胎便中的(p＜0．05)。MUFA中，新生儿胎便中含量较高的是油酸(C18∶1n－9)和棕榈油酸(C16∶1n－9)，二者在足月儿胎便中的含量明显低于早产儿胎便中的(p＜0．05)。PUFA中，新生儿胎便中主要是亚油酸(C18∶2n－6)，占总PUFA含量的88．0%～93．9%。本文检测的新生儿胎便中SSFA、MUFA、PUFA含量与Ｒan－Ｒessler等［14］所测结果相似。

BCFA中，足月儿胎便中BCFA种类最丰富，达31种，比早产儿多7种，其中以iso－C16∶0、iso－C22∶0和iso－C14∶0含量居多，而iso－C16∶0在不同胎龄的新生儿胎便中均为含量最高的BCFA。足月儿与早产儿胎便中的BCFA含量具有显著差异(p＜0．05)，含量最高的为足月儿胎便，最低的为早期早产儿胎便，但3个阶段的早产儿胎便间BCFA含量差异不显著(p＞0．05)。同时，新生儿胎便中BCFA以iso－BCFA和anteiso－BCFA类型为主，还有少量羟基脂肪酸(OHFA)，且足月儿胎便中iso－BCFA和anteiso－BCFA含量要明显高于早产儿的(p＜0．05)，不同胎龄新生儿胎便中anteiso－BCFA的含量都远低于iso－BCFA，而早产儿和足月儿胎便中的OHFA含量差异不显著(p＞0．05)。此外，相比早产儿，足月儿胎便中还含有5种非末端甲基BCFA(ntBCFA)，这可能是由于短碳链的BCFA易被早产儿消化吸收。

2．2新生儿肠道菌群结构组成差异分析

2．2．1Beta多样性分析

将14份新生儿胎便样本在OTU水平下进行主成分分析(PCA)，结果如图1所示。

图1新生儿胎便样本Beta多样性分析

由图1可知，同一组别的样本基本相距较近，不同组别样本则基本相距较远。14个胎便样本共可分为3组，其中足月男婴、足月女婴、早产女婴分别分布在第三象限、第一和第四象限、第二象限，较易区分，说明性别和胎龄2个因素都会对婴儿的肠道菌群组成产生影响［15］。同时，新生儿的菌群组成也受母亲的饮食、健康状况、分娩方式等的影响［16］。

2．2．2门水平上新生儿肠道菌群差异分析

新生儿肠道菌群在门水平上的相对丰度如图2所示。

图2新生儿门水平上的肠道菌群组成

由图2可知，新生儿肠道菌群主体有8个，分别为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、蓝藻细菌(Cyanobacteriota)、螺旋菌门(Spirochaetota)。在足月儿中，变形菌门和厚壁菌门占菌群主要优势，占总数的63%～95%，变形菌门和厚壁菌门的占比情况与之前报道结果［17－18］基本一致。与足月儿不同，早产儿肠道菌群主要由变形菌门和拟杆菌门组成，其次是放线菌门和厚壁菌门。

2．2．3属水平上新生儿肠道菌群差异分析

新生儿肠道菌群在属水平上的相对丰度如图3所示。

图3新生儿属水平上的肠道菌群组成

由图3可知，新生儿肠道菌群中排名前10的菌群分别为假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、罗尔斯通菌属(Ｒalstonla)、芽孢杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、红球菌属(Ｒhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、剑菌属(Ensifer)、从毛单胞菌属(Comamonas)。新生儿肠道中部分菌群的性别差异明显(p＜0．05)，男婴和女婴中的优势菌属存在区别，分别为乳杆菌属和假单胞菌属。这可能是因为不同性别新生儿在母体中摄入胎脂的BCFA组成和含量不同，导致男婴和女婴早期的肠道菌群组成存在差异。由此推测，男婴和女婴早期肠道菌群组成的区别可能是日后发生性别相关疾病的原因。

2．3新生儿肠道菌群和BCFA含量的相关性分析

通过对14份胎便中4种不同类型的BCFA含量和门水平上的肠道菌群相对丰度进行皮尔逊相关性分析，探讨新生儿肠道菌群和BCFA的相关性，结果如表2所示。

表2新生儿胎便BCFA含量与新生儿肠道菌群相关性分析

由表2可知，iso－BCFA含量与厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度存在显著相关性，相关系数分别是0．598与－0．580。anteiso－BCFA含量只与放线菌门相对丰度存在显著负相关性。OHFA含量分别与蓝藻细菌与螺旋菌门相对丰度存在显著正相关和极显著负相关性。厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度均与BCFA含量存在显著相关性，并且拟杆菌门相对丰度与BCFA含量相关性极显著。在肠道内，支链氨基酸可通过拟杆菌门完成发酵降解为支链短链脂肪酸［19］，而细菌的生长、流动性以及膜中BCFA含量会受到外源脂肪酸的影响，对肠道微生物的组成产生影响，进而对婴儿的免疫调节系统造成影响。

3、结论

本文通过GC－MS对新生儿胎便中BCFA组成和含量进行分析，发现胎便中共31种BCFA，以iso－BCFA和anteiso－BCFA为主。与早产儿相比，新生足月儿胎便中的BCFA含量更高(p＜0．05)。采用16SrＲNA测序技术对新生儿肠道微生物群结构组成分析发现:门水平上，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为新生儿肠道微生物群的优势菌群;属水平上，男婴和女婴的优势菌群分别为乳杆菌属和假单胞菌属。本文首次将胎便中BCFA含量与新生儿肠道菌群进行相关性分析，发现BCFA含量与新生儿肠道中厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻细菌、螺旋菌门均显著相关，其中BCFA含量与拟杆菌门的相关性最显著(p＜0．01)。综上，BCFA含量与新生儿肠道菌群具有一定相关性。该研究为BCFA在婴儿乳品中的应用提供了一定的理论基础。

由于未经过抗生素治疗的早产儿人群比较少见，收集过程比较困难，因此本研究收集到的样本数量较少，今后的研究可收集更多样本以更深入地探究BCFA与人体肠道健康的相关性。

参考文献:

[1]王秀文,韦伟,王兴国,等.支链脂肪酸的来源与功能研究进展[J].中国油脂,2018,43(12):88-92.

[3]张宇,王立娜,张宏达,等.母乳､牛乳及山羊乳脂肪酸组成的差异分析[J].食品工业科技,2019,40(4):21-26.

文章来源:陆慧佳,李唯迪,安丽娜,等.胎便中支链脂肪酸与新生儿肠道菌群的相关性研究[J].中国油脂,2025,50(05):69-74.