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葛根素通过调节类泛素化修饰平衡改善心肌功能的研究

2021-04-14 117 上传者：管理员

摘要：目的：从小泛素样修饰蛋白(SUMO)介导SUMO化修饰平衡角度解读葛根素对心力衰竭(HF)的心功能保护作用及机制。方法：通过主动脉缩窄术造成压力超负荷诱导HF,成功构建小鼠HF模型后，小鼠随机分为对照组、模型组、模型+葛根素组、葛根素组，每组6只；HL-1细胞构建HF模型，分为对照1组、模型1组、模型+葛根素1组、对照2组、模型2组、模型+葛根素2组，其中前3组转染Vector质粒，后3组转染HA-SENP1质粒。超声心动检测心室功能；苏木精-伊红染色检测心肌组织形态；蛋白印迹法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、活化型Caspase-3、Bcl2、Bax和SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)蛋白水平；JC-1试剂检测线粒体膜电位；TUNEL检测HL-1细胞凋亡情况。结果：与对照组比较，模型组小鼠线粒体内活性氧及H2O2均增加，线粒体膜电位下降(P<0.05),与模型组比较，模型+葛根素组可改善HF小鼠心脏功能，活性氧和H2O2降低，线粒体膜电位增加，活化型Caspase-3/Caspase-3比值下降、Bcl2/Bax比值增加、SENP1蛋白下降(P<0.05)。与模型1组相比，模型+葛根素1组活性氧及H2O2减少，线粒体膜电位升高(P<0.05)。与模型+葛根素1组比较，模型+葛根素2组细胞内H2O2和活性氧增加，线粒体膜电位降低，细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论：葛根素通过抑制SENP1过表达，减弱HF小鼠心肌细胞的氧化应激，减轻线粒体损伤，抑制心室重构，最终改善心脏功能。

关键词：
小泛素相关修饰蛋白质类
心力衰竭
膜电位
葛根素
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慢性心力衰竭(CHF)主要表现为心脏结构异常，导致心脏充盈或射血功能受损[1]。大多心力衰竭(HF)预后不良。尽管过去30年里，HF的生存率有显著的改善，但5年病死率仍然接近50%[2]。中药治疗HF的不良反应为4.08%,西药治疗的不良反应为9.81%。葛根素是从葛根中提取的主要活性成分，已证实在体内和体外HF模型中的有效性和安全性[3]。但其在HF中的作用机制尚不明确。研究表明，小泛素样修饰蛋白(SUMO)特异性蛋白酶1(SENP1)作为去SUMO化酶，在抑制心肌细胞肥厚及心脏功能障碍中发挥重要作用[4]。我们猜测葛根素是否通过调控SENP1抑制HF的发生发展。基于此，本研究通过主动脉缩窄术构建小鼠HF模型，体内观察葛根素对HF小鼠心功能的保护作用及对心肌细胞氧化应激的影响；且在小鼠心房肌细胞株HL-1细胞系中干预SENP1表达，明确葛根素对HF心肌的保护作用是否与SENP1有关。

1、材料与方法

1.1动物和主要材料

8～10周龄雄性C57BL/6J小鼠24只，体质量24～26g,购于中国医学科学院实验动物研究所(北京)。葛根素购自美国Sigma公司。小鼠心房肌细胞株HL-1细胞系购自美国ATCC公司，含HA标签及SENP1的蛋白质编码区片段的慢病毒质粒由苏州吉玛基因股份有限公司构建。心肌细胞凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl2、Bax、SENP1和β肌动蛋白(β-actin)抗体均购自美国CST公司，二抗购自美国Jackson公司。线粒体膜电位(ΔΨm)、活性氧检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2建立动物模型及实验分组

24只小鼠随机分为对照组、模型组、模型+葛根素组、葛根素组，每组6只。模型组、模型+葛根素组小鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥钠80mg/kg(W×0.06)麻醉后，经主动脉弓缩窄术造成压力超负荷诱导HF。6周后，通过超声心动图检查判断小鼠是否构建成功HF模型；对照组和葛根素组小鼠同样暴露主动脉弓，但不结扎。术后6周，模型+葛根素组及葛根素组隔日腹腔注射50mg/kg葛根素，对照组及模型组予同等剂量溶剂，药物干预4周后，心脏超声检查后处死小鼠。

1.3超声心动检查

术后8周，大鼠用丙巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，采用Vevo770和716探针动态评估大鼠的心功能。M型示踪获得左心室收缩末期内径(LVESD)和左心室舒张末期内径(LVEDD),高分辨率心电图自动获得LVEF和缩短分数(FS)。

1.4心肌组织学检测

心肌组织固定72h后，脱水石蜡包埋心肌组织，切片厚4μm,用苏木精-伊红染色，光镜下观察染色情况。

1.5HA-SENP1过表达质粒设计和细胞培养及转染

用HL-1细胞提取的总RNA,通过RT-PCR获得小鼠SENP1的全长cDNA,将SENP1全长cDNA亚克隆到在c端带有标记序列(HA标签)的哺乳动物细胞慢病毒表达载体pWPXL(LifeTechnologies公司)中，实验中以pWPXL空载质粒(Vector)作为阴性对照，观察HA-SENP1质粒转染是否增加HL-1细胞的SENP1表达。

HL-1细胞在特定的培养皿中培养，用杜尔贝科改良的Eagle's培养液(DMEM),在37℃、5%CO2、95%的湿润空气中添加10%FBS、100U青霉素和链霉素。当HL-1细胞密度达到40%～50%时，按照Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂盒的说明书进行转染，通过慢病毒转染技术获得稳定的SENP1过表达HL-1细胞系。

HL-1细胞构建HF模型，并分为对照1组、模型1组、模型+葛根素1组、对照2组、模型2组、模型+葛根素2组，其中前3组转染Vector质粒，后3组转染HA-SENP1质粒。Vector以及HA-SENP1质粒转染24h后，模型组给予异丙肾上腺素20μmol/L处理，模型+葛根素组同时给予异丙肾上腺素20μmol/L及葛根素30μmol/L处理，对照组给予同等剂量的葛根素溶剂处理，均处理24h后，各组检测ΔΨm及活性氧，实验温度控制在37℃。

1.6心肌线粒体的分离和各项氧化应激指标测量

将小鼠左心室组织进行线粒体分离，通过组织线粒体分离试剂盒(Beyotime)利用差异离心，分离线粒体和细胞质，并按照试剂盒的说明书进行分离。线粒体通过荧光读板机检测，HL-1细胞用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞荧光变化。

将分离的线粒体或者HL-1细胞分别与JC-110μg/ml或者2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)10μmol/L各自孵育20min,分别测量ΔΨm和活性氧，其中JC-1单体的绿色荧光的激发光和发射光分别为488nm和525nm,JC-1聚合体的红色荧光的激发光和发射光分别为543nm和590nm。DCFH-DA的激发光和发射光分别为488nm和525nm。JC-1检测各组的荧光强度变化以聚合体/单体表示ΔΨm;DCFH-DA共聚焦检测各组活性氧的荧光强度值以对照组的百分率表示。

用AmplexRed过氧化氢检测试剂盒检测分离的线粒体或者HL-1细胞中H2O2含量，H2O2的荧光在543nm处激发，在590nm处收集。

1.7Westernblot检测心肌细胞凋亡相关蛋白及SENP1蛋白表达

将等量的蛋白裂解物在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶上电泳并转移到聚偏二氟乙烯膜上。5%的牛奶室温封闭1h,在4℃用不同的一抗对膜进行过夜孵育，用二抗在室温孵育1h,用增强化学发光方法进行显色。凋亡相关蛋白表达以活化型Caspase-3/Caspase-3比值和Bcl2/Bax比值表示。

1.8TUNEL染色检测细胞凋亡

HL-1细胞经处理后，在4%多聚甲醛中固定40min,3%H2O2封闭10min,0.1%Tritonx-100渗透3min。用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche,Indianapolis,USA)检测，凋亡细胞用TUNEL反应混合液标记，细胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，荧光显微镜随机获取图像，用ImageProPlus图像分析软件进行标记细胞计数。凋亡率以TUNEL阳性细胞与总细胞的比值表示。

1.9统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料用x¯±s表示，采用方差分析，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组小鼠体质量和心脏质量及心功能指标比较

与对照组比较，模型组小鼠体质量无明显变化(P>0.05),心脏质量及心脏质量/体质量明显增加(P<0.05);与模型组比较，模型+葛根素组小鼠心脏质量及心脏质量/体质量明显降低(P<0.05)。与对照组比较，模型组小鼠LVEF和FS明显下降、LVEED和LVESD明显增加(P<0.05);与模型组比较，模型+葛根素组小鼠LVEF和FS明显增加、LVEED和LVESD明显下降(P<0.05)。葛根素组与对照组各指标比较无统计学差异(P>0.05,表1)。

表1各组小鼠体质量和心脏质量及心功能指标比较

2.2各组小鼠心肌组织及心肌线粒体氧化应激情况

苏木精-伊红染色显示(图1～4),与对照组比较，模型组小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱、细胞间质最多，同时有炎性浸润；与模型组比较，模型+葛根素组小鼠心肌组织心肌细胞缩小，排列较整齐，炎细胞明显减少。

图1对照组图2模型组图3葛根素组图4模型+葛根素组图1～4各组小鼠心肌形态苏木精-伊红染色×200

对照组、模型组、葛根素组和模型+葛根素组小鼠心肌线粒体内活性氧分别为(100.00±4.03)%、(210.00±12.15)%、(98.00±5.43)%和(130.00±9.44)%,与对照组相比，模型组心肌细胞线粒体内活性氧增加(P<0.05);与模型组比较，模型+葛根素组心肌细胞粒体内活性氧降低(P<0.05)。

对照组、模型组、葛根素组和模型+葛根素组小鼠心肌线粒体内H2O2分别为(100.00±7.73)%、(167.00±4.81)%、(95.00±9.14)%和(114.00±10.03)%,与对照组比较，模型组心肌线粒体内H2O2增加(P<0.05);与模型组比较，模型+葛根素组心肌细胞线粒体内H2O2降低(P<0.05)。

对照组、模型组、葛根素组和模型+葛根素组小鼠ΔΨm分别为0.93±0.04、0.48±0.05、1.03±0.07和0.79±0.03,与对照组比较，模型组ΔΨm下降(P<0.05);与模型组比较，模型+葛根素组ΔΨm升高(P<0.05)。

2.3各组小鼠心肌细胞凋亡相关蛋白及SENP1蛋白比较

对照组、模型组、葛根素组和模型+葛根素组小鼠活化型Caspase-3/Caspase-3比值和Bcl2/Bax比值各为100.00±2.09、162.00±9.42、96.00±8.63和115.00±6.01;100.00±4.72、46.00±8.82、103.00±3.74、89.00±6.13。4组的SENP1蛋白各为100.00±3.80、157.00±5.02、92.00±8.42、113.00±6.53。与对照组比较，模型组活化型Caspase-3/Caspase-3比值增加，Bcl2/Bax比值下降(P<0.05),与模型组比较，模型+葛根素组活化型Caspase-3/Caspase-3比值下降、Bcl2/Bax比值增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组心肌细胞内SENP1表达增加，与模型组比较，模型+葛根素组SENP1表达降低，差异有统计学意义(P<0.05,图5)。

2.4各组HL-1细胞H2O2和活性氧比较

与Vector质粒转染比较，HA-SENP1质粒转染明显增加HL-1细胞的SENP1表达(156.00±12.63vs100.00±4.91,P<0.05,图6)。

图5各组小鼠心肌凋亡相关蛋白及SENP1蛋白表达

图6HL-1细胞中HA-SENP1转染效果

与模型1组比较，模型+葛根素1组细胞内H2O2和活性氧减少，与模型+葛根素1组比较，模型+葛根素2组细胞内H2O2和活性氧增加(P<0.05,图7,表2)。

表2HL-1细胞H2O2、活性氧和ΔΨm及细胞凋亡情况比较

图7SENP1过表达后对HL-1细胞中活性氧的影响

2.5各组HL-1细胞的ΔΨm和细胞凋亡情况比较

与模型1组比较，模型+葛根素1组ΔΨm升高，细胞凋亡率降低，与模型+葛根素1组比较，模型+葛根素2组ΔΨm降低，细胞凋亡率升高(P<0.05,表2,图8)。

图8SENP1过表达后对HL-1细胞ΔΨm的影响

3、讨论

据估计，CHF患者5年和10年生存率分别为50%和10%,在发展中国家更低[2]。心室重构是CHF的重要病理特征，其可导致心室功能不全、耗氧量增加，甚至心源性死亡[5]。抑制心室重构是CHF患者的首要治疗靶点，为此开展了大量研究。

葛根素治疗HF方面的研究十分广泛。葛根素可通过氧化物酶体增殖物激活受体途径抑制心肌细胞凋亡和炎性反应[6]。葛根素可明显改善心血管参数和心功能[3]。本研究发现，葛根素可抑制HF小鼠心脏质量及心脏质量/体质量比值增加、抑制小鼠LVEF、FS下降、LVEED和LVESD增加等。

HF心肌产生的活性氧增加，导致进一步心肌损伤[7]。葛根素具有抗氧化、抗炎等作用。研究发现，葛根素抑制单核细胞黏附，减少载脂蛋白E-/-小鼠的动脉粥样硬化[8]。线粒体与细胞凋亡密切相关，ΔΨm下降是细胞凋亡早期的重要指标。同样，本研究在小鼠HF模型发现，葛根素可降低HF小鼠心肌活性氧和H2O2水平，抑制ΔΨm下降。

SUMO是一类结构与泛素相似但功能迥异的蛋白质翻译后修饰形式，它通过与靶蛋白上特定赖氨酸位点结合，形成靶蛋白/SUMO复合体，发挥稳定靶蛋白结构、介导浆核移位、调控下游转录因子、调节蛋白间相互作用或拮抗泛素化等生物学功能。与泛素化修饰循环通路相似。研究表明，SENP1的异常在氧化应激损伤中发挥着重要的作用[9]。基于此，本研究检测了不同处理组心肌组织SENP1表达情况，观察葛根素是否通过调控SENP1抑制HF发生发展过程中的氧化应激。结果显示，与对照组相比，模型组SENP1蛋白表达增加，而葛根素处理后，可抑制SENP1蛋白的过表达。提示SENP1可能在葛根素改善心室功能中发挥着重要作用。为验证这一假设，本研究以HL-1细胞构建SENP1的过表达质粒，经稳定的基因转染后，检测细胞内活性氧、H2O2、ΔΨm的变化，结果显示，在HF模型基础上，SENP1过表达后，模型组心肌细胞凋亡增加，可有效抑制葛根素的抗氧化应激效应，表明SENP1可能参与葛根素的心肌保护作用。

总之，本研究在主动脉弓结扎诱导的小鼠HF模型上，证实葛根素通过降低SENP1过表达，减弱HF小鼠心肌细胞的氧化应激，减轻线粒体损伤，抑制心室重构、促进心脏功能的改善，该机制的发现为HF的治疗提供了新的理论依据和临床参考。

参考文献：

[1]柴坷,王华,李莹莹,等.老年射血分数保留的心力衰竭患者合并冠心病的心脏病理学特征[J].中华心血管病杂志,2017,45(8):710-715.

边希云,肖晓琳,薛娜,于田,马晓芳,李艳霞,刘晓智,杜新平.葛根素通过调节类泛素化修饰平衡改善心肌功能的研究[J].中华老年心脑血管病杂志,2021,23(04):417-421.