牙周病是一种牙周支持组织的慢性炎症性疾病，可能导致牙龈萎缩、牙槽骨丧失、牙齿松动等症状[1]。以干细胞为基础的再生工程研究在牙周病治疗中表现出良好前景[2]。牙周膜干细胞具有分化为成骨细胞、成牙骨质细胞等的多向分化潜能[3]，加之方便易得的特性，成为牙周再生工程中最有前景的种子细胞之一[4,5]。

雌激素是一类具有广泛生物学活性的类固醇类激素，对心血管系统、生殖系统、骨代谢等多方面都有影响[6]。作为调节骨代谢和成骨诱导的重要影响因素之一，临床试验证实雌激素治疗能改善骨密度、增加骨量，对改善绝经期妇女骨质疏松症状有良好效果[7]。雌激素可抑制成骨细胞凋亡，延长细胞寿命，从而改善其细胞功能；同时，破骨细胞中也存在雌激素的直接靶点，通过诱导破骨细胞凋亡和抑制RANKL介导的破骨细胞分化对其产生直接作用[8,9]。另外还有相当多的证据表明，雌激素可通过成骨细胞和T细胞介导对破骨细胞的间接作用[10,11]。课题组前期实验证实：经典Wnt/β-catenin信号通路对雌激素刺激下人牙周膜干细胞成骨分化产生促进作用，但对该通路的抑制并不能降低成骨相关标志物的表达[12]。

细胞信号通路间呈现复杂的网络状结构。作为非经典Wnt信号家族的成员之一，Wnt/Ca2+信号通路被证实可调控多种细胞生命活动，如细胞增殖、多向分化潜能、细胞衰老和凋亡等[13]。Wnt5a和Wnt11与Frizzled受体结合激活Wnt/Ca2+通路，导致包括IP3、Ca2+在内的某些细胞内信号分子短期内增加，从而激活下游钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKII)，上调TAK1-NLK信号转导通路[14]，而NLK可通过磷酸化TCF/LEF转录因子抑制Wnt/β-catenin通路。现有研究证实，Wnt/Ca2+信号通路可调节干细胞的成骨分化[15]，而上调miR-26a-5p可通过直接作用于Wnt5amRNA的3'端非翻译区，从而下调Wnt/Ca2+信号通路表达，有效抑制小鼠脂肪干细胞的成骨分化[16]。

由此，作者假设：在Wnt/β-catenin信号通路外，Wnt/Ca2+信号通路也参与了人牙周膜干细胞中雌激素诱导的成骨分化，两者相互影响，共同调节细胞成骨分化。该研究分别(或同时)使用2种通路抑制剂XAV939和L-690,330来研究Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路在雌激素刺激下对人牙周膜干细胞成骨分化的调控和交叉串扰，通过对雌激素介导成骨分化相关通路的研究，探讨促进牙周组织再生的调控机制，以期为雌激素在牙周病治疗、牙周再生工程中的运用提供实验依据。

1、材料和方法

1.1 设计

体外细胞分离培养、鉴定，诱导细胞成骨分化，组间数据比较采用独立样本t检验和单因素方差分析。

1.2 时间及地点

实验于2018年6月至2020年6月在西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室完成。

1.3 材料

12-14周岁患者因正畸需要拔除的健康前磨牙(由西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科门诊提供，获得患者及家属的知情同意)。α-MEM培养基(Hyclone，美国)；青霉素-链霉素溶液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA、TritonX-100(碧云天，中国)；Ⅰ型胶原酶(Biosharp，中国)；磷酸缓冲盐粉剂(PBS)(北京中杉金桥，中国)；地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(Sigma，美国)；茜素红S染色液(1%,pH4.2)、饱和油红O染色液(Solarbio，中国)；小鼠抗人的STRO-1、CD146、CD90、CD29、CD45、CD31流式抗体(BD，美国)；碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒(建成，中国)；Fluo-4荧光探针(Themor，美国)；总RNA提取试剂盒(天根，中国)；ReverTraAceqPCRRTMasterMix(TOYOBO，日本)；FastqPCRMasterMix(生工，中国)；Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939、Wnt/Ca2+通路抑制剂L-690,330(Abcam，美国)；Anti-CaMKII抗体(ab134041,Abcam，美国)；Anti-RUNX2抗体(ab76956,Abcam，美国)；Anti-OCN抗体(ab133612,Abcam，美国)；Anti-GAPDH抗体(PAB36269,BioSwamp，中国)。

1.4 实验方法

1.4.1 人牙周膜干细胞的分离、纯化培养和鉴定

获得患者及家属的知情同意后，在西南医科大学附属口腔医院门诊部选择牙周状况良好，年龄在12-14周岁间的患者，因正畸需要拔除前磨牙，共20颗。冲洗干净表面血污后，用刀片将牙周膜从牙根中三分之一处刮下，用Ⅰ型胶原酶充分消化后，放入含有体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的α-MEM培养液中，置于37℃，体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养。约7d后，原代人牙周膜细胞爬出，每2d换液1次，当细胞生长融合达到80%后，用有限稀释法分离纯化得到人牙周膜干细胞。选择第3代细胞用于后续实验。

将第3代人牙周膜干细胞与抗CD146、CD45、CD31、CD29、CD90和STRO-1的单克隆抗体共同孵育，进行流式细胞技术分析，鉴定细胞表面标志物。

将第3代人牙周膜干细胞(5×103/cm2)接种于6孔板中，当细胞聚合度达到70%-80%时，加入成骨诱导培养液，培养21d后茜素红染色检测细胞成骨分化潜能。将第3代人牙周膜干细胞(5×103/cm2)接种于6孔板中，当接种细胞聚合度达100%时，加入成脂诱导培养液，培养21d后油红O染色检测成脂分化潜能。

1.4.2 细胞分组

选择第3代人牙周膜干细胞，随机分为6组。

(1)空白组：用体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的α-MEM培养液培养；(2)对照组：用含50mg/L抗坏血酸、5mmol/Lβ-甘油磷酸钠、100nmol/L地塞米松的成骨诱导培养液培养；(3)雌激素组：用含10-7mol/L雌激素的成骨诱导培养液培养；(4)L-690,330组：用含10-7mol/L雌激素，0.05mol/LL-690,330的成骨诱导培养液培养；(5)XAV939组：用含10-7mol/L雌激素，5mmol/LXAV939的成骨诱导培养液培养；(6)L-690,330+XAV939组：用含10-7mol/L雌激素，0.05mol/LL-690,330,5mmol/LXAV939的成骨诱导培养液培养。

1.4.3 成骨分化潜能鉴定

将第3代人牙周膜干细胞(5×103/cm2)接种于6孔板中，当细胞聚合度达到70%-80%时，按上述方法分组培养7d，茜素红染色检测细胞成骨分化潜能，显微镜下观察；然后用10%的氯化十六烷基吡啶提取茜素红后，使用多功能酶标仪检测570nm波长处的吸光度值。

1.4.4 细胞内Ca2+浓度检测

使用Fluo-4钙分析试剂盒进行细胞内Ca2+浓度检测。将第3代人牙周膜干细胞以5×106L-1细胞浓度接种于6孔板，每孔2mL，按上述方法分组培养7d,吸除原培养液，用PBS轻轻荡洗细胞2次，加入Fluo-4检测液，37℃孵育30min，倒置显微镜下观察，采集图片，用ImageJ软件进行图像分析。

1.4.5 碱性磷酸酶活性检测

将第3代人牙周膜干细胞以5×106L-1细胞浓度接种于6孔板，每孔2mL，按上述方法分组培养7d，使用碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶活性检测试剂盒进行定性定量检测，用酶标仪检测520nm波长处吸光度值。

1.4.6 RT-PCR检测相关基因表达

将第3代人牙周膜干细胞以5×106L-1细胞浓度接种于6孔板，每孔2mL，按上述方法分组培养7d，提取各组样本的总RNA进行反转录和PCR扩增。所用引物序列如表1所示。采用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.4.7 Westernblot检测相关蛋白表达

将第3代人牙周膜干细胞以5×106L-1细胞浓度接种于6孔板，每孔2mL，按上述方法分组培养7d，吸去原培养液，加入RIPA蛋白裂解液，4℃冰上充分裂解细胞，将细胞刮入1.5mLEP管中，超声破碎仪裂解细胞并4℃低温离心后，用BCA法测定各样本蛋白浓度。添加LoadingBuffer溶液，混合均匀，100℃下持续10min煮沸，分装后-20℃储存。总蛋白样品回温振荡混匀后上样，以120V的恒压电泳45-60min，当溴酚蓝染料跑到胶底部时即可终止电泳。转膜，封闭。将目的蛋白膜放进加有An■-CaMKII、An■-RUNX2、An■-OCN、An■-GAPDH稀释一抗液的孵育盒中，4℃孵育过夜，第2天取出一抗孵育后的膜，冲洗，室温孵育二抗1h，孵育结束后，将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，通过TANONGIS软件读取相关条带灰度值。

1.5 主要观察指标

(1)空白组、对照组、雌激素组人牙周膜干细胞内Ca2+浓度和Wnt/Ca2+通路相关基因及蛋白的表达水平；(2)分别(或同时)使用Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路抑制剂后人牙周膜干细胞的碱性磷酸酶染色及定量分析，茜素红染色及定量分析；(3)分别(或同时)使用Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路抑制剂后人牙周膜干细胞的成骨相关基因及蛋白表达水平；(4)分别(或同时)使用Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+通路抑制剂后人牙周膜干细胞的胞内Ca2+浓度和Wnt/β-catenin、Wnt/Ca2+通路相关基因表达水平。

1.6 统计学分析

采用SPSS22.0进行统计学分析。各实验重复3次，数据以表示，数据正态性检验及方差齐性检验满足后再通过独立样本t检验和单因素方差分析(one-wayANOVA)，采用LSD法和S-N-K法比较两两组间差异，P<0.05为差异有显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。

2、结果

2.1 人牙周膜干细胞表面标志物及多向分化潜能鉴定结果

倒置显微镜下观察，原代细胞在组织块贴壁培养约7d后爬出，呈纺锤形或多角形，放射状生长。细胞数量逐渐增多，聚集成旋涡状，排列规律，形态均一，见图1A。纯化及传代培养后，人牙周膜干细胞呈聚集状生长，多层重叠，局部堆积成灶状，见图1B,C。流式细胞技术显示，表面抗原标志物CD90、CD29、CD146、STRO-1阳性率分别为99.25%,98.66%,79.45%,19.36%，而CD31、CD45阳性率为0.67%和0.23%，见图1D，证明细胞为间充质来源，不含淋巴系细胞或内皮细胞成分。成骨诱导培养21d，茜素红染色观察到大量橘红色钙盐形成，见图1E。成脂诱导培养21d，油红O染色可见细胞内脂滴数量明显增多，见图1F。

2.2 雌激素调控Wnt/Ca2+信号通路

成骨诱导培养7d后，Fluo-4检测见图2A，与空白组相比，对照组细胞内Ca2+浓度显著升高(P<0.01)，雌激素组进一步上升(P<0.01)。成骨诱导7d后，对照组CaMKII和NLK基因表达水平较空白组显著升高，雌激素组进一步上升，差异有显著性意义，见图2B。CaMKII的蛋白表达水平与基因表达水平变化一致，见图2C。

2.3 Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路共同参与雌激素作用下人牙周膜干细胞成骨分化的调控

成骨诱导7d后，与雌激素组相比，L-690,330组和XAV939组碱性磷酸酶水平降低，但差异无显著性意义(P>0.05)。L-690,330+XAV939组碱性磷酸酶水平明显低于雌激素组(P<0.001)，见图3A。茜素红染色及定量分析得到了相似的变化，见图3B。qRT-PCR检测成骨标志物Runx2和OCN的基因水平也得到类似结果：成骨诱导7d后，L-690,330组和XAV939组的Runx2和OCN基因水平均低于雌激素组，但差异无显著性意义(P>0.05)。而L-690,330+XAV939组较雌激素组明显下降(P<0.001)，见图4A。Westernblot检测结果见图4B,L-690,330和XAV939组Runx2和OCN蛋白表达都低于雌激素组(P<0.001)，而L-690,330+XAV939组对成骨分化的抑制作用最强(P<0.001)。

2.4 Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路间相互串扰

与雌激素组相比，L-690,330组细胞内Ca2+浓度降低(P<0.05),XAV939组细胞内Ca2+浓度升高(P<0.05),L-690,330+XAV939组细胞内Ca2+降低(P<0.01)，见图5A。qRT-PCR结果显示：L-690,330组CaMKII、NLK基因表达量明显低于雌激素组(P<0.001)，但β-catenin基因表达量较高(P<0.001)。XAV939组CaMKII和NLK基因表达量高于雌激素组(P<0.01)，而β-catenin基因表达量低于雌激素组(P<0.01)。L-690,330+XAV939组与雌激素组相比，这3个基因的表达水平均较低(P<0.001)，见图5B。

3、讨论

Wnt信号家族依赖于各种受体或受体复合物，激活2种不同的信号通路：经典和非经典Wnt信号通路[17]。Wnt信号通路被证实对不同细胞具有不同的成骨分化作用，而这些通路并非完全独立，往往存在相互串扰和影响[18]。课题组前期研究发现，雌激素可以激活经典Wnt/β-catenin信号通路，并促进人牙周膜干细胞的成骨分化，而抑制该通路不会下调成骨标志物的表达[12]。于是作者假设非经典Wnt/Ca2+信号通路也参与调节了雌激素介导的成骨分化。

非经典Wnt信号通路主要由Wnt/PCP信号通路和Wnt/Ca2+信号通路组成。Wnt/PCP信号通路主要调节细胞运动，而Wnt/Ca2+信号通路对细胞的多种生命活动，如细胞增殖、多向分化潜能、衰老和凋亡进行调控[19]。Wnt/Ca2+信号通路的关键启动子Wnt5a和Wnt11与特异性受体Frizzled结合，导致包括Ca2+在内的某些细胞内信号分子增加[13]，随后激活下游信号因子CaMKII。此外，CaMKII的激活可上调TAK1-NLK信号转导通路，而NLK可通过磷酸化TCF/LEF转录因子抑制Wnt/β-catenin通路的表达[14]。

研究显示，雌激素可以直接或间接促进细胞内Ca2+转运[20]。在该研究中，雌激素诱导成骨培养7d后，细胞内Ca2+浓度和CaMKII、NLK的基因表达增加，CaMKII的蛋白水平也有所增加，表明雌激素对成骨分化具有积极作用，同时也促进了Wnt/Ca2+信号通路的表达。

实验使用选择性抑制剂XAV939和L-690,330进一步探索2种信号通路的作用。XAV939通过稳定Axin来促进β-catenin的降解，可选择性抑制β-catenin介导的转录，是Wnt/β-catenin信号通路的小分子抑制剂[21]。同时，双磷酸盐化合物L-690,330可以阻断Frizzled-2触发的细胞内Ca2+释放，竞争性抑制肌醇单磷酸酶，有效抑制Wnt/Ca2+信号通路[22]。该研究中，碱性磷酸酶、茜素红染色、Runx2和OCN基因检测结果显示，单独抑制Wnt/Ca2+信号通路或Wnt/β-catenin信号通路并不能显著下调人牙周膜干细胞的成骨分化，而同时抑制会导致Runx2和OCN成骨分化能力下调；Westernblot结果显示共同抑制2种信号通路会得到最大程度的成骨抑制效果。也就是说，对Wnt信号通路的抑制作用可以减弱诱导成骨分化的效果，但这种削弱效果在2种信号通路都抑制的情况下得到最好表达。

虽然2种信号通路都在雌激素介导的成骨分化中扮演角色，但他们之间或许存在交叉串扰，共同调控成骨分化发生。在该研究中，Ca2+浓度的变化和CaMKII、NLK、β-catenin的基因表达量均提示L-690,330能有效阻断Wnt/Ca2+信号通路。抑制Wnt/Ca2+信号通路后，Wnt/β-catenin信号通路被激活。XAV939抑制Wnt/β-catenin信号通路，激活Wnt/Ca2+信号通路。这或许表明2种信号通路在雌激素介导的人牙周膜干细胞成骨分化中存在相互补偿的关系，任一通路的下调会补偿性上调另一通路表达，以维持诱导成骨分化的效果。

Wnt5a种类蛋白作为非经典Wnt信号通路的关键因子之一，可以使细胞黏附降低，从而拮抗被认为是经典Wnt/β-catenin通路启动蛋白的Wnt1类蛋白[23]。同时，Wnt3a和白细胞介素1引起的Ca2+浓度增加，会导致与质膜相关的AnxA6上调，进而导致Wnt/β-catenin信号通路受到抑制[24]。此外，有研究表明，酪氨酸激酶2(Pyk2)对Wnt3a的激活发挥了显著作用，在诱导人神经祖细胞分化过程中，协调Wnt/β-catenin和Wnt/Ca2+信号通路间β-catenin的稳定，并有助于β-catenin转运至细胞核[25]。结合该实验结果，后续研究可以从沉默Wnt/β-catenin、Wnt/Ca2+通路关键基因(β-catenin、CaMKII、NLK)入手，通过对成骨相关基因及蛋白表达水平检测，验证雌激素刺激下分别(或同时)下调2种信号通路表达后细胞成骨能力的变化，从而进一步证实Wnt通路及通路间串扰在上述调控中存在的作用。同时，质谱分析作为蛋白质组学的重要研究手段[26]，筛选出雌激素刺激下成骨诱导培养后表达上升的Wnt家族蛋白，通过对关键蛋白的进一步研究，探讨2种信号通路在诱导细胞成骨分化中的作用及相互串扰。

关于雌激素调节骨代谢的研究显示，绝经期妇女体内雌激素水平下调不仅会影响全身骨量，对牙槽骨形成及骨密度高低也有显著影响[27]。雌激素替代治疗可以通过改善牙槽骨骨量，减少附着丧失等，对绝经期妇女的牙周状况进行改善[28]，接受替代治疗的患者缺失牙数目也明显减少[29]。此外，姚丽等[30]学者关于雌激素替代治疗绝经期伴骨质疏松牙周病的研究显示，雌激素替代疗法对此类患者牙周系统的疗效改善与对照组比较差异无显著性意义。现有研究对雌激素运用于牙周治疗及牙周组织改建的探究尚不明确，而对雌激素诱导人牙周膜干细胞成骨分化机制的探索可以进一步揭示雌激素在骨代谢调节中的具体作用，以期为调节雌激素水平优化骨生成、骨改建，以及雌激素运用于临床牙周组织再生治疗提供新的思路。

综上所述，Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/β-catenin信号通路共同参与雌激素作用下人牙周膜干细胞成骨分化的调控，两通路间存在交叉串扰。该研究探讨雌激素微环境下人牙周膜干细胞成骨分化的调控机制，为基于干细胞的牙周组织再生工程研究提出了新的思路和挑战。

参考文献:

[3]李晓钰,王红,谷秀格,等.年龄因素对牙周膜千细胞多向分化能力的影响[J].口腔生物医学,2019,10(2):78-82.

[6]李微,张博,张雨薇,等.雌激素调节骨代谢作用的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2017,23(2);262-266.

[7]刘云,罗晓婷,李崇,等.雌激素治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J].实用临床医学,2020,21(10);91-96.

[9]马刚李理,覃永保等.大鼠双侧卵巢切除术后不同时期血清骨生化标志物与骨小梁三维结构变化之间的研究[J].医学研究杂志,2016,45(5).76-80.

[11]张文韬,陈勋.宋涛,等.缺氧诱导因子抑制剂对去卵巢大鼠骨质疏松症治疗效果的研究[J].中国骨质疏松杂志,2018,24(12):1601-1605.

[17]张世怪,张旭.Wnt信号通路在肿瘤调控方面的研究进展[J].中国药理学通报,2017,33(1):14-18.

[26]曹文达,蒋世—,鲁晓杰.基于ITRAQ技术的无功能性垂体瘤血清蛋白质组学分析[J].临床神经外科杂志,2017,14(3);220-224.

[30]姚丽,黄薇,刘莹.雌激素替代疗法对绝经期骨质疏松伴牙周病患者系统治疗的影响[J].中国骨质疏松杂志,2015,21(2).196-198.

文章来源：金珂,吴晓玲,罗小玲,胥鹏飞,徐晓梅.雌激素刺激下人牙周膜干细胞成骨分化及通路间的交叉串扰[J].中国组织工程研究,2022,26(24):3886-3891.