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《美国药典》(USP42-NF372S)通则<1227>验证药品微生物回收情况

2020-07-22 2935 上传者：管理员

摘要：《中华人民共和国药典》、美国药典(USP)及欧洲药典(EP)等均指出具有抑菌性产品的微生物计数、检测、抑菌效力检查或无菌检查，应首先中和其抑菌性，并需对中和抑菌性的方法进行验证。《美国药典》通则<1227>药品微生物回收的验证首次详细阐释了中和方法验证方案的设计和试验结果的判定，对于完善药品微生物检查方法、保证微生物检测结果准确，具有指导意义。本文将《美国药典》(USP42-NF37 2S)通则<1227>章节译出，以期为医药界的科研工作者提供参考。

关键词：
微生物回收验证
微生物学
抑菌性
无菌检查法
美国药典
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1、概述

本章节为以下检查方法的验证提供指导:制药产品的存活微生物计数法、指示菌或者控制菌检查法及无菌检查法。抑菌效力检查法〈51〉、无菌检查法〈71〉、微生物计数法〈61〉和控制菌检查法〈62〉项下的检查步骤都是经过验证的。但是，药典方法的应用需要方法学适用性试验，以证明产品存在时挑战微生物得以回收。若对这些章节描述的回收步骤(如稀释，化学或酶的中和以及薄膜过滤)进行替代/改变均需要进行验证。众所周知，若一个产品由于防腐剂或处方原因而具有抑菌性，需对抑菌性进行中和以复苏存活微生物。通过使用中和剂、稀释法、稀释、薄膜过滤和冲洗结合法或以上方法的结合，来实现中和作用。若产品本身对某一特定微生物具有抑菌性，由于这种抑菌性，微生物污染的风险较低，可据此认为方法适用于其目的。

2、影响因素

验证设计时应考虑影响供试品溶液抑菌性测定的因素。这些因素包括:挑战微生物的微生物特性、挑战微生物的接种物制备、试验的具体条件和复苏条件。即使不考虑产品的抑菌性，这些因素也影响水性产品或非水性产品回收方法的验证。因此，所有测试方法进行验证时均应考虑以上因素。

挑战微生物的特性很大程度上影响其对抑菌剂的反应和回收所需的中和作用。药典测试中有代表性的微生物是革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌、酵母和霉菌。测试中的每种微生物均应包含在验证中。

挑战微生物的接种物制备也影响抑菌活性产品的检测。挑战微生物的生长与制备决定了细胞的生理状态。这一状态直接影响抑菌作用检测的结果。微生物测试不使用单个细胞，而是收集一群细胞用于研究。若细胞群是均匀的，那么由这些研究得到的数据变异性较小。液体培养物或固体平板培养物最适宜于作为可重复的培养物制备。微生物制备和储存的条件应标准化以用于中和剂的评估，并应反映出抑菌测试的条件。

试验的具体条件包括缓冲液、水、光线及温度，均应可重复。所有的测试条件应标准化，验证研究应使用与检查相同的测试条件。

微生物复苏的条件，是准确评估待测溶液微生物数目的最重要环节之一。首先应考虑用于支持幸存微生物生长的复苏培养基，下面会予以详细讨论。第二是考虑培养条件，需有适宜条件来保证充分生长和结果可重复。

3、抑菌性的中和方法

中和产品抑菌性的三种常见方法是:(1)化学抑制，(2)稀释，和(3)过滤和冲洗。

3.1化学中和

表1列出了针对多种化学干扰物的已知中和剂，以及一些化学中和剂对特定微生物的已报道毒性。然而，尽管存在潜在毒性，化学抑制剂的方便快捷还是促进了它们的使用。抑菌效力测试中，首选抑菌剂的化学中和方法。在薄膜过滤法及直接接种法进行无菌检查应考虑化学中和剂的潜在作用。抗生素可能不受化学中和作用的影响，但酶还是起作用的(如青霉素酶)，酶可以在需要时使用。

表1化学抑菌剂的常见中和剂

3.2稀释

第二种中和产品抑菌性的方法是稀释，因为化学抑菌剂的浓度很大程度上决定了抑菌作用的强弱。浓度和抑菌作用的关系随不同的杀菌剂而不同，但是对特定的抑菌剂是恒定的。该关系可用幂函数表示:

公式1

其中C是抑菌剂浓度;η是浓度指数(稀释系数)，是logt对logC作图的斜率;t是杀死标准接种物的时间;k是常数;高η的抑菌剂通过稀释可以快速中和，对于低η抑菌剂，通过稀释去除抑菌活性的效果不明显(见表2)。

表2一些常见抑菌剂的浓度指数

3.3薄膜过滤法

薄膜过滤法是经常使用的一种方法，尤其在无菌检查中。该方法依赖于微生物在膜上的物理截留，抑菌剂则过滤至滤液中。培养滤膜使存活微生物复苏。然而，仅靠过滤也许不能充分去除抑菌剂以使幸存微生物生长。粘附在滤膜上的残存抑菌剂可能抑制微生物生长。使用低吸附滤膜过滤，如聚偏二氟乙烯，可以减少抑制作用。另外，可以用无毒冲洗液冲洗滤膜以稀释和去除防腐剂，如液体A(见无菌检查法〈71〉下薄膜过滤法使用的稀释液和冲洗液)。冲洗液中的化学中和剂能保证膜上的残留抑菌剂不影响存活微生物的复苏。

4、中和方法的验证———回收比较

一个能够中和产品抑菌性的验证方法应满足两个标准:中和剂有效性和中和剂无毒性。验证研究应证明中和方法能有效抑制产品抑菌性(中和剂有效性)，同时又不会破坏存活微生物回收(中和剂无毒性)。通过比较不同处理组的回收结果，判断验证方案是否满足上述两个标准。

第一个是试验组，向经过中和方法处理的样品中加入低水平挑战微生物(小于100 cfu)进行回收。第二个是蛋白胨对照组，与供试液相同的中和方法处理蛋白胨或者液体A(见无菌检查法〈71〉薄膜过滤法稀释和冲洗液体)。第三个是菌液组，使用接种物，不采用中和方法处理。若试验组与蛋白胨对照组回收结果接近，说明中和剂有效;若蛋白胨对照组与菌液组回收结果接近，说明中和剂毒性可接受。

原则上，方案必须表明低水平(小于100 cfu)接种物的回收不会被样品和中和方法所抑制。通过比较三个不同组的回收结果证明验证方案满足上述两个标准:(1)加入接种物的经中和方法处理样品组，(2)在缓冲液中加入挑战微生物的接种物对照组，(3)不含中和剂和产品的接种物组。通过直接比较实验组(1)和接种物(3)结果可以得出结论。如果经处理的供试品溶液组与接种物组结果不一致，应该判断中和方法本身是否对微生物有毒性。

4.1琼脂培养基上的回收

抑菌效力检查法〈51〉和微生物计数法〈61〉项下的测试中，样品内存活挑战微生物的数目是根据平板计数法计算出的每毫升的菌落数进行估算的。中和验证设计应包含“中和方法的验证———回收比较”中描述的各处理组。至少进行三次独立实验，每次实验应证明，与不含样品的对照组相比，任一试验菌的回收率应在50%至200%之间。

若验证需要更多次重复，可以将CFU数目转换成它们的对数值，采用T检验或方差分析(ANOVA)对数据进行统计分析(用于比较所有试验组)，然后比较。若使用ANOVA，并且确定了总体的显著性差异，可以使用Dunnet-t检验，其中蛋白胨组作为对照组。

4.2薄膜过滤的回收

除把滤膜贴在固体培养基上以定量回收外，本验证遵循无菌检查法〈71〉方法适用性试验程序。应当强调的是，无菌检查方法适用性试验不需要进行定量回收。只需要进行定性评估(视觉浑浊度)。假定100 m L冲洗三次，但是冲洗的体积和次数均应进行验证。最大使用100 m L冲洗五次，即使方法适用性试验表明其不能充分去除抑菌性。每个验证均应至少进行三次独立实验。在供试品溶液组中，样品经膜过滤器被滤过，用稀释中和液体冲洗，每次100 m L共冲洗2次。完成第二次冲洗后，用含有小于100 cfu挑战微生物的冲洗液100 m L进行最后一次冲洗。然后将滤膜贴至适宜的琼脂培养基培养复苏。

接种物直接接种固体培养基。由于滤膜固有毒性或微生物粘附于过滤容器壁，过滤导致挑战微生物回收结果降低是有可能的。可以使用对照组评估薄膜过滤验证本部分内容。稀释剂液体A用作稀释培养基以避免滤膜接触样品。在最后一次冲洗液中加入低水平接种物，像上述一样将滤膜贴至适宜琼脂培养基。通过比较稀释剂液体A组的回收结果和接种数目，估算因技术带来的微生物损失。

本部分假定供试品是可以过滤的。如果必须要溶解供试品，必须评估溶解方法对微生物的影响。这可能发生在检测药膏、悬浮液或其他产品时。

若供试品溶液和对照液体A的三次独立重复试验回收率接近，可认为方法经过验证。

4.3液体培养基的回收

无菌检查法〈71〉中“供试品的无菌检查”“直接接种法”中假定复苏培养基能够允许所有存活微生物的生长。该检查中使用的液体既能中和待测样品的抑菌性，又能支持微生物生长。“中和方法的验证———回收比较”中描述的不同处理组可用于复苏方法的验证，变换产品和复苏培养基的比例以实现充分的中和。若在〈71〉规定时间内，与不含产品的对照组相比，各试验组均显示清晰可见的生长，则认为方法经过验证。

5、受损微生物的回收

上述验证均使用未与抑菌剂接触的挑战微生物，因此与抑菌效力检查中的微生物或防腐产品无菌检查中存在的微生物不同。若需要使用替代培养基，应在验证中对受损微生物的复苏进行研究。可通过直接比较受损微生物暴露于产品后，在推荐培养基和替代培养基上的回收结果完成。除非抑菌剂杀灭速率极快，即微生物暴露后立即接种也不能复苏，暴露应至少包含小于100 cfu·m L-1能够生长的两个时间段。该比较应至少重复三次。若替代培养基上的回收结果不低于药典培养基，误差在0.5log10单位范围内，则替代培养基通过验证。

6、CFU数目估算

对活细胞cfu数目估算的准确性受接种数目影响。随接种数目上升，拥挤效应会降低计数准确性，使估算数目降低。随接种数目降低，随机错误在估算中作用越来越大。对于大部分细菌和白色念珠菌，一个标准琼脂平板上可接受的计数范围是25～250 cfu。这一范围是食品工业计数牛奶中大肠杆菌时确定的，适用于除真菌外的药典微生物，不适用于计数环境分离菌株。计数巴西曲霉的推荐范围是每平板8～80 cfu。

应对最高稀释级的低计数限值进行确认。平板上的菌落数目遵从泊松分布，所以平均值的变异性等同菌数平均值。因此，随着每个平板cfu平均值的降低，估算的误差比例会增加(见表3)。例如，10-1稀释级时，每平板3cfu得到的菌数为30 cfu·m L-1，误差为58%。

表3平板计数的平均误差

参考文献：

[1]中华人民共和国药典2015年版.四部[S]. 2015:137ChP 2015. VolⅣ[S]. 2015:137.

[2]USP42-NF37 2S[S]. 2019:9616.

[3]EP 9. 0[S]. 2017:185.

解慧,刘洪祥,杨倩,曹晓云.《美国药典》(USP42-NF372S)通则<1227>药品微生物回收的验证[J].中国药品标准,2020,21(02):146-149.